A 3D bioprinted hydrogel gut-on-chip model with integrated TEER sensing capabilities

Abstract

En la darrera dècada, els 'organ-on-chips' s'han convertit en una alternativa prometedora als models in vitro convencionals i als in vivo basats en animals. Mitjançant la integració de la microfluídica en els cultius cel·lulars, aquests sistemes poden recrear forces mecàniques a què les cèl·lules epitelials i endotelials estan exposades en el seu microentorn cel·lular dinàmic. Entre els diferents models de teixit desenvolupats en aquest camp, els 'gut-on-chips' han estat àmpliament estudiats a causa del rol clau de l'intestí prim en l'absorció de nutrients i fàrmacs. Tot i això, molts dels dispositius de 'gut-on-chips' actualment proposats només representen l'epiteli intestinal, obviant altres elements importants de la mucosa intestinal. Com que estan basats en membranes semi poroses rígides i planes, aquests models són incapaços de reproduir l'estructura compartimentalitzada de la barrera. La mucosa intestinal s'organitza amb una arquitectura multicel·lular i tridimensional (3D), conformada per protrusions en forma de dits anomenades vellositats, i invaginacions anomenades criptes, en la qual les cèl·lules estromals embegudes dins de la matriu extracel·lular (ECM) interactuen amb l'epiteli per a mantenir la seva integritat i funció. Per tal de reproduir condicions similars a l'in vivo, els hidrogels han estat proposats com a substrats cel·lulars idonis, ja que poden donar suport tant a la formació d'una barrera com a la incorporació d'altres cèl·lules. Aquests materials estan estructurats com a matrius poroses de cadenes polimèriques capaces d'absorbir grans quantitats de fluids. Tenen propietats mecàniques i químiques adaptables que poden ser ajustades perquè corresponguin a les dels teixits tous, igual que permeten la difusió d'oxigen i nutrients per a cultius cel·lulars. A més, l'adopció recent de tècniques de microfabricació ha permès generar substrats que repliquen aspectes topogràfics 3D claus del teixit intestinal. Tenint en compte tots aquests beneficis, la combinació dels hidrogels 3D amb la tecnologia microfluídica podria portar la rellevància fisiològica dels 'gut-on-chips' encara més lluny.

En aquest treball, presento un nou 'gut-on-chip' basat en un canal d'hidrogel biomimètic que recapitula els compartiments epitelials i estromals. L'hidrogel va ser fabricat mitjançant una tècnica de bioimpressió 3D amb llum visible per generar estructures amb forma de vellositats que reproduïssin elements espacials clau de l'epiteli intestinal. La composició de l'hidrogel va ser una barreja de polietilenglicol diacrilat (PEGDA), un polímer sintètic que proveeix estabilitat mecànica al substrat, i anhídrid metacrílic de gelatina (GelMA), un hidrogel natural biocompatible que permet l'encapsulació de cèl·lules. Els paràmetres d'impressió van ser inicialment optimitzats per obtenir estructures amb pilars laterals que repliquessin les dimensions fisiològiques de les vellositats intestinals. Darrere d'això, el canal d'hidrogel va ser col·locat dins d'un xip microfluídic per a perfusió contínua. Utilitzant aquesta configuració, es va poder comprovar que el sistema permet cultivar cèl·lules estromals embegudes dins de l'hidrogel durant diversos dies sota flux. També es va demostrar que el 'gut-on-chip' permet el co-cultiu de cèl·lules epitelials i la formació d'una barrera durant 2 setmanes, imitant l'arquitectura 3D compartimentalitzada de la mucosa intestinal sota condicions dinàmiques similars a l'in vivo. Fent un pas més enllà, vaig aconseguir integrar elèctrodes dins el 'gut-on-chip' 3D bioimprès per a la quantificació de la resistència elèctrica transepitelial (TEER) en temps real. Utilitzant espectroscòpia d'impedància electroquímica (EIS), la formació d'una barrera epitelial va poder ser monitoritzada periòdicament durant l'experiment, demostrant les capacitats del nostre 'gut-on-chip' basat en un hidrogel 3D bioimprès com a potencial eina per avaluar canvis precisos de permeabilitat en models de teixits en condicions sanes i patofisiològiques, igual que estudis d'avaluació de fàrmacs.

En la última década, los 'organ-on-chips' se han convertido en una alternativa prometedora a los modelos in vitro convencionales y a los in vivo basados en animales. Mediante la integración de la microfluídica en los cultivos celulares, estos sistemas pueden recrear fuerzas mecánicas a las que las células epiteliales y endoteliales están expuestas en su microentorno celular dinámico. Entre los diferentes modelos de tejido desarrollados en este campo, los 'gut-on-chips' han sido ampliamente estudiados debido al rol clave del intestino delgado en la absorción de nutrientes y fármacos. Sin embargo, muchos de los dispositivos de 'gut-on-chips' actualmente propuestos solo representan el epitelio intestinal, obviando otros elementos importantes de la mucosa intestinal. Al estar basados en membranas semi porosas rígidas y planas, estos modelos son incapaces de reproducir la estructura compartimentalizada de la barrera. La mucosa intestinal se organiza con un arquitectura multicelular y tridimensional (3D), conformada por protrusiones en forma de dedos llamadas vellosidades, e invaginaciones denominadas criptas, en la cual las células estromales embebidas dentro de la matriz extracelular (ECM) interactúan con el epitelio para mantener su integridad y función. Con el fin de reproducir condiciones similares al in vivo, los hidrogeles han sido propuestos como sustratos celulares idóneos, ya que pueden dar soporte tanto a la formación de una barrera como a la incorporación de otras células. Estos materiales están estructurados como matrices porosas de cadenas poliméricas capaces de absorber grandes cantidades de fluidos. Poseen propiedades mecánicas y químicas adaptables que pueden ser ajustadas para que correspondan a las de los tejidos blandos, al igual que permiten la difusión de oxígeno y nutrientes para cultivos celulares. Además, la adopción reciente de técnicas de microfabricación ha permitido la generación de sustratos que replican aspectos topográficos 3D claves del tejido intestinal. Teniendo en cuenta todos estos beneficios, la combinación de los hidrogeles 3D con la tecnología microfluídica podría llevar la relevancia fisiológica de los 'gut-on-chips' aún más lejos.

En este trabajo, presento un nuevo 'gut-on-chip' basado en un canal de hidrogel biomimético que recapitula los compartimentos epiteliales y estromales. El hidrogel fue fabricado mediante una técnica de bioimpresión 3D con luz visible para generar estructuras con forma de vellosidades que reprodujesen elementos espaciales clave del epitelio intestinal. La composición del hidrogel fue una mezcla de polietilenglicol diacrilado (PEGDA), un polímero sintético que provee estabilidad mecánica al sustrato, y anhídrido metacrílico de gelatina (GelMA), un hidrogel natural biocompatible que permite la encapsulación de células. Los parámetros de impresión fueron inicialmente optimizados para obtener estructuras con pilares laterales que replicasen las dimensiones fisiológicas de las vellosidades intestinales. Tras esto, el canal de hidrogel fue colocado dentro de un chip microfluídico para perfusión continua. Utilizando esta configuración, se pudo comprobar que el sistema permite cultivar células estromales embebidas dentro del hidrogel durante varios días bajo flujo. También se demostró que el 'gut-on-chip' permite el co-cultivo de células epiteliales y la formación de una barrera durante 2 semanas, imitando la arquitectura 3D compartimentalizada de la mucosa intestinal bajo condiciones dinámicas similares al in vivo. Dando un paso más allá, logré integrar electrodos dentro del 'gut-on-chip' 3D bioimprimido para la cuantificación de la resistencia eléctrica trans-epitelial (TEER) en tiempo real. Utilizando espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS), la formación de una barrera epitelial pudo ser monitorizada periódicamente durante el experimento, demostrando las capacidades de nuestro 'gut-on-chip' basado en un hidrogel 3D bioimprimido como potencial herramienta para evaluar cambios precisos de permeabilidad en modelos de tejidos en condiciones sanas y patofisiológicas al igual que estudios de evaluación de fármacos.

During the last decade, organ-on-chips have become a promising alternative to conventional in vitro and animal-based in vivo models. By integrating microfluidics with cell culture, these systems can recreate key mechanical forces to which epithelial and endothelial barriers are exposed to in their dynamic cell microenvironment. Among the different tissue models developed in the field, gut-on-chips have been largely studied due to the key role of the small intestine in nutrient absorption and drug uptake. However, most of the currently proposed gut-on-chip devices only represent the intestinal epithelium, neglecting other important elements of the intestinal mucosa. As these models are based on stiff and flat semi-porous membranes, they are unable to recapitulate the compartmentalized structure of the barrier. The intestinal mucosa organizes as a multicellular and three-dimensional (3D) architecture, shaped in finger-like protrusions called villi and invaginations called crypts where stromal cells embedded in the extracellular matrix (ECM) interact with the epithelium to maintain their integrity and function. To reproduce these in vivo-like conditions, hydrogels have been proposed as suitable cell substrates, as they can support both barrier formation and cell embedding. Structured as porous networks of polymer chains able to absorb large amounts of fluids, they possess highly tunable mechanical and chemical properties that can be adjusted to match those of soft tissues while allowing the diffusion of oxygen and nutrients for cell culture. Also, recent adoption of microfabrication techniques has resulted in the generation of scaffolds that mimic key 3D topographical features of the intestinal tissue. Considering all these benefits, the combination of engineered 3D hydrogels and microfluidic technology could push the physiological relevance of gut-on-chips even further.

In this work, I present a novel gut-on-chip based on a biomimetic hydrogel channel that recapitulates the epithelial and stromal compartments. The hydrogel was fabricated with a visible-light 3D bioprinting technique to generate villi-like structures reproducing key spatial features of the intestinal epithelium. The hydrogel composition was a mix of poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA), a synthetic polymer that provides mechanical stability to the scaffold, and gelatin methacryloyl (GelMA), a biocompatible natural hydrogel that enables cell encapsulation. Printing parameters were initially optimized to obtain lateral pillar structures that matched the physiological dimensions of intestinal villi. After this, the hydrogel channel was placed within a microfluidic chip for continuous perfusion. Using this configuration, the system can support the cell culture of hydrogel-embedded stromal cells for several days under flow. It was also proved that the gut-on-chip could support the co-culture of epithelial cells and their barrier formation for 2 weeks, mimicking the 3D compartmentalized architecture of the intestinal mucosa under in vivo-like dynamic conditions. As a step further, I successfully integrated electrodes within the 3D bioprinted gut-on-chip device for real time trans-epithelial electrical resistance (TEER) quantification. Using electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the evolution and formation of the epithelial barrier was monitored during the experiment, demonstrating the capabilities of the 3D hydrogel gut-on-chip as a potential tool to finely assess barrier permeability changes for tissue modeling in healthy and pathophysiological conditions along with drug assessment studies.