Physiological control of Pichia pastoris for the production of recombinant proteins: A novel Respiratory Quotient control based on Artificial Intelligence and scale-up of the bioprocess

Abstract

En una primera etapa de la present tesi, es va dur a terme una caracterització de l'efecte de la limitació d'oxigen (hipòxia) sobre la producció recombinant de la lipasa 1 de Candida rugosa (Crl1) mitjançant cultius en continu amb dos clons diferents de P. Pastoris, un que disposava d'una còpia del gen CRL1 (single-copy clone o SCC) i un altre que en disposava de 5 còpies (multicopy clone o MCC). Es van provar diferents graus de limitació d'oxigen variant la concentració d'oxigen en el gas d'entrada, definit aquelles condicions que es consideraven òptimes en termes de producció de Crl1 i que no comprometien significativament el creixement del llevat. Les velocitats específiques de producció (qP) van ser fins a 2 vegades més grans en hipòxia que en normòxia (condicions completament aeròbiques), tot i que aquest increment de producció de Crl1 va resultar més important per al SCC que per al MCC. Addicionalment, es va definir el Quocient Respiratori (RQ) com a variable per a controlar el nivell de limitació d'oxigen, ja que aquesta és una variable que depèn només de l'estat fisiològic de la biomassa, i per tant, es pot utilitzar com a variable indicadora a l'hora d'implementar el mateix grau d'hipòxia en un altre equip o mode d'operació. Posteriorment, un cop definides les condicions de limitació d'oxigen òptimes, es van replicar aquestes condicions en fed-batch. Els resultats obtinguts van ser similars als obtinguts en quimiòstat, duplicant la qP del SCC en condicions d'hipòxia i obtenint, però, un increment menor en el cas del MCC. A més, els resultats van ser corroborats gràcies a un estudi de transcriptòmica dels gens relacionats amb la producció de Crl1 mitjançant qPCR. Per finalitzar aquesta primera etapa de la tesi, es va dur a terme dues fermentacions a escala pilot, utilitzant el RQ com a criteri de canvi d'escala per tal d'aplicar les mateixes condicions d'hipòxia, obtenint una producció de Crl1 lleugerament més baixa que a escala laboratori però validant l'estratègia de limitació d'oxigen i la utilització del RQ com a paràmetre de control transferible entre diferents sistemes experimentals. La segona etapa de la tesi va consistir en millorar el controlador de RQ en fed-batch, que inicialment estava basat en la modificació manual i intermitent de la velocitat d'agitació per tal d'augmentar o disminuir la transferència d'oxigen al medi de cultiu (control manual-heurístic). Es van establir dues estratègies de control de RQ sofisticades. La primera va ser dissenyada, programada i desenvolupada a través del software Eve, el qual va permetre la implementació de soft sensors per tal de fer un càlcul precís i acurat del RQ i actuar sobre la velocitat d'agitació de forma automàtica. D'altra banda, la segona va consistir en un controlador proporcional adaptatiu, en què el valor del paràmetre proporcional del controlador s'anava actualitzant a cada minut de la fermentació basant-se en la predicció d'un model d'intel·ligència artificial (IA), i va ser dissenyada conjuntament en col·laboració amb membres de l'empresa AIZON, que van ser qui en van programar el codi. Aquesta estratègia ha esdevingut una prova de concepte per demostrar com es pot utilitzar la IA per a dur a terme el control automàtic de bioprocessos. Finalment, com a últim capítol de la tesi, l'estratègia hipòxica es va provar amb dues soques de P. Pastoris més, expressant dues proteïnes diferents: la lipasa de Rhizopus oryzae (proRol) i la lipasa B de Candida antarctica (CalB), dues lipases amb interès industrial. Les millores de producció obtingudes en aplicar condicions hipòxiques van ser equiparables a les obtingudes amb la producció de Crl1, validant així l'estratègia hipòxica per a la millora de producció de proteïnes recombinants.

En una primera etapa de la presente tesis, se llevó a cabo una caracterización del efecto de la limitación de oxígeno (hipoxia) sobre la producción recombinante de la lipasa 1 de Candida rugosa (Crl1) mediante cultivos en continuo con dos clones diferentes de P. Pastoris, uno que disponía de una copia del gen CRL1 (single-copy clone o SCC) y otro que disponía de 5 copias (multicopy clone o MCC). Se probaron distintos grados de limitación de oxígeno variando la concentración de oxígeno en el gas de entrada, definido aquellas condiciones que se consideraban óptimas en términos de producción de Crl1 y que no comprometían significativamente el crecimiento de la levadura. Las velocidades específicas de producción (qP) fueron hasta 2 veces mayores en hipoxia que en normoxia (condiciones completamente aeróbicas), aunque este incremento de producción de Crl1 resultó mayor para el SCC que para el MCC. Adicionalmente, se definió el Cociente Respiratorio (RQ) como variable para controlar el nivel de limitación de oxígeno, ya que ésta es una variable que depende sólo del estado fisiológico de la biomasa, y por tanto, se puede utilizar como variable indicadora a la hora de implementar el mismo grado de hipoxia en otro equipo o modo de operación. Posteriormente, una vez definidas las condiciones de limitación de oxígeno óptimas, se replicaron estas condiciones en fed-batch. Los resultados obtenidos fueron similares a los obtenidos en quimiostato, duplicando la qP del SCC en condiciones de hipoxia y obteniendo un incremento menor en el caso del MCC. Además, los resultados fueron corroborados gracias a un estudio de transcriptómica de los genes relacionados con la producción de Crl1 mediante qPCR. Para finalizar esta primera etapa de la tesis, se llevó a cabo dos fermentaciones a escala piloto, utilizando el RQ como criterio de cambio de escala para aplicar las mismas condiciones de hipoxia, obteniendo una producción de Crl1 ligeramente más baja que a escala laboratorio pero validando la estrategia de limitación de oxígeno y la utilización del RQ como parámetro de control transferible entre distintos sistemas experimentales. La segunda etapa de la tesis consistió en mejorar el controlador de RQ en fed-batch, que inicialmente estaba basado en la modificación manual e intermitente de la velocidad de agitación para aumentar o disminuir la transferencia de oxígeno al medio de cultivo (control manual-heurístico). Se establecieron dos estrategias de control de RQ sofisticadas. La primera fue diseñada, programada y desarrollada a través del software Eve, que permitió la implementación de soft sensores para realizar un cálculo preciso y cuidadoso del RQ y actuar sobre la velocidad de agitación de forma automática. Por otra parte, la segunda consistió en un controlador proporcional adaptativo, en el que el valor del parámetro proporcional del controlador se iba actualizando a cada minuto de la fermentación en base a la predicción de un modelo de inteligencia artificial (IA), y fue diseñada conjuntamente en colaboración con miembros de la empresa AIZON, que fueron quienes programaron su código. Esta estrategia se ha convertido en una prueba de concepto para demostrar cómo se puede utilizar la IA para llevar a cabo el control automático de bioprocesos. Por último, como último capítulo de la tesis, la estrategia hipóxica se probó con otras dos cepas de P. Pastoris, expresando dos proteínas diferentes: la lipasa de Rhizopus oryzae (proRol) y la lipasa B de Candida antarctica (CalB), dos lipasas con interés industrial. Las mejoras de producción obtenidas al aplicar condiciones hipóxicas fueron equiparables a las obtenidas con la producción de Crl1, validando así la estrategia hipóxica para la mejora de producción de proteínas recombinantes.

In the first stage of the present thesis, a characterization of the effect of hypoxia on the recombinant production of Candida rugosa lipase 1 (Crl1) with P. pastoris was carried out using continuous cultures. Two different clones of P. pastoris were tested, one harboring one copy of the CRL1 gene (single-copy clone or SCC) and another harboring 5 copies of it (multicopy clone). Different degrees of oxygen limitation were tested by varying the oxygen concentration in the inlet gas of the fermenter, and the optimal conditions for Crl1 production, which did not compromise severely the yeast growth, were defined. Continuous cultures in steady state (chemostats) were used to test different conditions reaching different steady states, resulting in specific production rates (qP) up to two-fold higher under hypoxia compared to normoxia (completely aerobic conditions), although this increase in Crl1 production was higher for the SCC than for the MCC. Additionally, the Respiratory Quotient (RQ) was defined as a control variable to regulate the oxygen limitation degree, as it depends on the physiological state or the type of metabolism that cells conduct. Moreover, this variable is independent of the equipment and system used so, it can be used as a reporting variable to implement the same hypoxic degree in another equipment or operational mode. Subsequently, once these optimal hypoxic conditions had been defined, they were replicated in fed-batch cultures. Since they are dynamic cultures where biomass concentration increases over time, the control of the process to maintain a constant level of oxygen limitation should also be dynamic. The results obtained in fed-batch cultures were similar to those in chemostat cultures, doubling the qP of SCC under hypoxic conditions, but obtaining a lower increase in the case of MCC. In addition, these results were further confirmed through transcriptomic analysis of certain genes related to Crl1 production using qPCR. Next, two pilot-scale fermentations were conducted, using RQ as a scale-up criterion to apply the same hypoxic conditions. Although Crl1 production was slightly lower at the pilot scale than at the lab scale, it validated the oxygen limitation strategy and the use of RQ as a transferable control parameter between different experimental setups. The second stage of the thesis consisted of the refinement of the RQ controller in fed-batch, which was initially based on a manual and intermittent modification of agitation rate to adjust oxygen transfer into the culture broth (manual-heuristic control). Thus, two improved RQ control strategies were established in this second chapter, both of which consisted of adjusting the agitation rate automatically as the process required. The first strategy, named "Boolean-logic controller" was designed, programmed, and developed using a specific fermenter control software called Eve. It allowed the implementation of soft sensors to make a precise and accurate RQ calculation and act over agitation rate in an automated way. In contrast, the second control strategy consisted of an adaptive proportional controller, in which the value of the proportional parameter was updated every minute. This parameter value adaptation was based on an artificial intelligence (AI) model, and it was designed in collaboration with members of the company AIZON, who programmed the code. This strategy served as a proof of concept to demonstrate how AI can be used for the automatic control of bioprocesses. Finally, the hypoxic strategy was tested with two additional strains of P. pastoris, expressing two different proteins: Rhizopus oryzae lipase (proRol) and Candida antarctica lipase B (CalB), two lipases with industrial interest. The improvements in production observed under hypoxic conditions were comparable to those obtained with Crl1 production, thus validating the hypoxic strategy for the enhancement of recombinant protein production.