Nanomedicine and TLR agonists in the treatment and prevention of canine leishmaniosis due to L. infantum

Abstract

La leishmaniosi causada per protozous parasitaris del gènere Leishmania es considera una malaltia zoonòtica que afecta milions de persones, principalment a regions tropicals, amb un impacte en la salut i el desenvolupament socioeconòmic. La leishmaniosi canina clínica es manifesta amb un ampli espectre de signes clínics i anormalitats clinicopatològiques. Les manifestacions cutànies són les més comunes, sent la dermatitis papular una presentació típica en àrees endèmiques. La interacció de Leishmania amb el sistema immunitari de l'hoste implica una dinàmica complexa entre les respostes immunitàries innates i adaptatives que influeixen en el resultat de la malaltia. La immunitat adaptativa dels limfòcits T ha demostrat una associació de la resposta immunitària cel·lular a la resistència a la malaltia, així com una associació de la resposta humoral amb la malaltia clínica. La immunitat innata també ha demostrat tenir un paper crucial en el control de la infecció, així com en guiar el desenvolupament de respostes immunitàries adaptatives duradores. Els neutròfils són les primeres cèl·lules immunològiques a trobar el paràsit i fagocitar-lo. La progressió de la malaltia depèn de la interacció entre els sistemes d'eliminació del paràsit i els seus mecanismes d'evasió de les cèl·lules de la immunitat. Les opcions de tractament disponibles per a la infecció per Leishmania spp. no són òptimes, ja que, malgrat reduir els nivells de paràsits i millorar els signes clínics, no erradiquen completament la infecció i comporten un risc moderat d'efectes secundaris. A més, l'eficàcia del tractament es veu limitada per l'aparició de mecanismes de resistència en el paràsit en àrees endèmiques . L'objectiu general de la tesi va ser investigar noves eines per a la prevenció i el tractament, així com millorar el coneixement sobre la immunitat innata i adaptativa de la infecció per L. infantum en el gos. Aquesta tesi es va dividir en tres estudis principals (capítols 3, 4 i 5). Al capítol 3 es van avaluar la seguretat i eficàcia clínica de l'antimoniat de meglumina i l'administració local de biguanida de polihexametilè (PHMB) sol o en combinació amb un agonista de TLR4 en la resolució de lesions cutànies en gossos amb dermatitis papular deguda a la infecció per L. infantum, i es va avaluar la immunitat cel·lular i humoral específica del paràsit, així com la parasitèmia en el moment del diagnòstic i durant el període de seguiment d'aquests gossos. Al capítol 4 es van avaluar les variacions en l'activitat oxidativa dels neutròfils en la sang perifèrica mitjançant la taxa de nitroblue tetrazolium test (NBT) i es va investigar l'associació potencial entre l'activitat oxidativa dels neutròfils i les concentracions d'IFN-[Gamma] i els nivells d'anticossos en gossos en diferents estats d'infecció per L. infantum. Es van plantejar dues hipòtesis, la primera de les quals era que els gossos infectats seropositius sans o els gossos amb malaltia lleu (estadi I-dermatitis papular) mostraven una major proporció de neutròfils activats en la sang perifèrica que els gossos amb malaltia moderada a greu (estadis II-III), i la segona era que l'IFN-[Gamma] estava positivament associat amb els neutròfils activats en la sang perifèrica dels gossos amb infecció per L. infantum, així com inversament relacionat amb els nivells d'anticossos. Finalment, el capítol 5 va ser un estudi de fase I que va avaluar la seguretat i la resposta immunitària cel·lular i humoral específica de paràsit d'una vacuna candidata per a L. infantum en gossos. La hipòtesi d'aquest estudi era que aquesta vacuna candidata per a L. infantum indueix una resposta immunitària protectora caracteritzada per una forta resposta immunitària cel·lular i una resposta humoral específica lleu, així com un bon perfil de seguretat quan s'administra a Beagles sans.

La leishmaniosis causada por protozoos parasitarios del género Leishmania se considera una enfermedad zoonótica que afecta a millones de personas, principalmente en regiones tropicales, con un impacto en la salud y el desarrollo socioeconómico. La leishmaniosis canina clínica se manifiesta con un amplio espectro de signos clínicos y anormalidades clinicopatológicas. Las manifestaciones cutáneas son las más comunes siendo la dermatitis papular una presentación típica en áreas endémicas. La interacción de Leishmania con el sistema inmunitario del huésped implica una dinámica compleja entre las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas que influyen en el resultado de la enfermedad. La inmunidad adaptativa de los linfocitos T desempeña un papel importante, con una respuesta inmunitaria celular asociada a la resistencia a la enfermedad y una respuesta humoral relacionada con la enfermedad clínica. La inmunidad innata también desempeña un papel crucial en el control de la infección y el desarrollo de respuestas inmunitarias adaptativas duraderas. Los neutrófilos son las primeras células inmunológicas en reconocer el parásito y fagocitarlo. La progresión de la enfermedad depende de la interacción entre la eliminación del parásito y sus mecanismos de evasión de las células inmunes. Las opciones de tratamiento disponibles para la infección por Leishmania spp. no son óptimas, ya que, a pesar de reducir los niveles de parásitos y mejorar los signos clínicos, no erradican completamente la infección y conllevan un riesgo moderado de efectos adversos secundarios. Además, la eficacia del tratamiento se ve limitada por la aparición de mecanismos de resistencia en el parásito en áreas endémica. El objetivo general de la tesis fue investigar nuevas herramientas para la prevención y el tratamiento, así como, mejorar el conocimiento sobre la inmunidad innata y adaptativa de la infección por L. infantum en el perro. Esta tesis se dividió en tres estudios principales (capítulos 3, 4 y 5). En el capítulo 3 se evaluaron la seguridad y eficacia clínica del antimoniato de meglumina y la administración local de biguanida de polihexametileno solo o en combinación con un agonista de TLR4 en la resolución de lesiones cutáneas en perros con dermatitis papular debida a la infección por L. infantum, y se evaluaron la inmunidad celular y humoral específica del parásito, así como la parasitemia en el momento del diagnóstico y durante el período de seguimiento de estos perros. En el capítulo 4 se evaluaron las variaciones en la actividad oxidativa de los neutrófilos en la sangre periférica mediante la tasa de nitroblue tetrazolium test (NBT) y se investigó la asociación potencial entre la actividad oxidativa de los neutrófilos y las concentraciones de IFN-[Gamma] y los niveles de anticuerpos en perros en diferentes estados de infección por L. infantum. Se plantearon dos hipótesis, la primera de las cuales era que los perros infectados seropositivos sanos o los perros con enfermedad leve (estadio I-dermatitis papular) mostraban una mayor proporción de neutrófilos activados en la sangre periférica que los perros con enfermedad moderada a grave (estadios II-III), y la segunda era que el IFN-[Gamma] estaba positivamente asociado con los neutrófilos activados en la sangre periférica de los perros con infección por L. infantum, así como, inversamente relacionado con los niveles de anticuerpos. Finalmente, el capítulo 5 fue un estudio de fase I que evaluó la seguridad y la respuesta inmunitaria celular y humoral específica de parásito de una vacuna candidata para L. infantum en perros. La hipótesis de este estudio era que esta vacuna candidata para L. infantum induce una respuesta inmunitaria protectora caracterizada por una fuerte respuesta inmunitaria celular y una respuesta humoral específica leve, así como un buen perfil de seguridad cuando se administra a perros Beagle sanos.

Leishmaniosis caused by parasitic protozoans of the Leishmania genus is considered a zoonotic disease that affects millions of people mainly in tropical regions, impacting health and socioeconomic development. Clinical canine leishmaniosis is manifested by a broad spectrum of clinical signs and clinicopathological abnormalities. Cutaneous presentations are the most common, and papular dermatitis is considered a typical presentation in endemic areas. Leishmania's interaction with the host's immune system involves complex dynamics between innate and adaptive responses, influencing disease outcome. Adaptive T-cell immunity play a significant role, with a cellular immune response linked to disease resistance and humoral response to clinical illness. Innate immunity controls the infection and guides the development of durable, pathogen-specific adaptive immune responses. Neutrophils are the first immune cells to encounter the parasite and engulf it. Disease progression depends on the interaction between parasite elimination and its mechanisms of evasion of immune cells. Available treatment choices for Leishmania spp. infection are suboptimal, as despite often reducing parasite levels and improving clinical signs, they do not completely eradicate the infection and carry a moderate risk of side effects. Additionally, treatment effectiveness is limited due to the emergence of resistance mechanisms in the parasite in endemic areas. The general aim of this thesis was to investigate new tools for prevention and treatment as well as enhancing knowledge regarding innate and adaptive immunity for canine L. infantum infection. This thesis was divided in three main studies (chapters 3, 4 and 5). Chapter 3 specific objectives were to evaluate the safety and clinical efficacy of meglumine antimoniate and topical administration of polyhexamethylene biguanide (PHMB) used alone or in combination with a TLR4 agonist in the resolution of cutaneous lesions in dogs with papular dermatitis due to L. infantum infection, and to evaluate parasite-specific humoral and cellular immunity as well as parasitemia at the time of diagnosis and during the follow-up period of these dogs. Chapter 4 was meticulously structured to achieve the following specific objectives: to assess the variations in peripheral blood neutrophil oxidative activity by means of the nitroblue tetrazolium reduction test (NBT) rate and to investigate the potential association between neutrophil oxidative activity and IFN-[Gamma] concentrations and antibody levels in dogs in different states of L. infantum infection. Two hypotheses were made, the first being that healthy seropositive infected dogs or dogs with mild disease (stage I-papular dermatitis) show a higher proportion of activated neutrophils in peripheral blood than dogs in moderate to severe diseases (stages II-III), and the second that IFN-[Gamma] is positively associated to activated neutrophils in peripheral blood of dogs with L. infantum infection as well as inversely related to antibody levels. Finally, the last project was a phase I study (chapter 5) evaluating the safety and parasite-specific humoral and cellular immune response of a candidate vaccine for L. infantum in dogs. The hypothesis for this study was that this candidate vaccine for L. infantum induces a protective immune response characterized by a strong cellular immune response and a mild specific humoral response as well as a good safety profile when administered to healthy Beagles.