Proteomic insights into the immune response of rice plants to M. oryzae infection

Abstract

Les plantes enfronten constantment a una sèrie de factors ambientals, biòtics i abiòtics, afectant significativament el rendiment dels cultius. L'estrès biòtic és causat per organismes com fongs, bacteris o insectes, mentre que l'estrès abiòtic inclou la salinitat, la sequera o la disponibilitat de nutrients. Atesa la seva naturalesa immòbil, les plantes han desenvolupat mecanismes intrinsecs per afrontar aquests estressos mitjançant l'activació de vies de transducció de senyals i la reprogramació transcripcional de l'expressió genètica. A la natura, les plantes s'enfronten contínuament a estressos tant biòtics com abiòtics, dificultant significativament la seva productivitat. Les investigacions es centren en comprendre les respostes de les plantes a un estrès individual, ja que la seva combinació és complexa per la interferència entre les vies de senyalització. La regulació es pot donar a nivell postraduccional mitjançant la fosforilació proteica. No obstant, el nostre coneixement sobre els esdeveniments de fosforilació involucrats a les vies de senyalització induïdes per patògens i nutrients continua sent limitada. A més, s'ha demostrat que l'estat nutricional d'una planta influeix en la resistència a malalties. El fòsfor, adquirit del sòl en forma de fosfat inorgànic (Pi), és un nutrient essencial per al creixement i desenvolupament de les plantes. La baixa biodisponibilitat de Pi a sòls representa un factor limitant per al creixement de les plantes. En conseqüència, els fertilitzants de Pi s'utilitzen a l'agricultura moderna per optimitzar el rendiment dels cultius, causant un excés de Pi a les plantes. A nivell molecular, s'estudia com les plantes s'adapten a les condicions limitants de Pi mitjançant la Phosphate Starvation Response, encara que hi ha menys informació sobre la resposta a l'excés de Pi. En aquesta tesi doctoral, investiguem l'efecte i el mecanisme del Pi en la resposta de les plantes d'arròs a la infecció per patògens a nivell proteòmic, que dóna lloc a la resistència/susceptibilitat a malalties en l'arròs. A la Secció 1 descrivim el doble impacte del contingut de Pi a les fulles d'arròs tant a la planta com al fong patogen Magnaporthe oryzae. L'acumulació de Pi va afectar negativament la presència de Pathogenesis-related proteins a la planta, resultant en un fenotip susceptible. Simultàniament, hi va haver un augment en l'expressió dels efectors fúngics. A la Secció 2 es va explicar com, en plantes amb baix contingut de Pi, l'apoplast de la fulla es va enriquir amb proteïnes associades amb defensa, alineant-se amb la resistència observada contra M. oryzae. A la Secció 3, es va realitzar una anàlisi fosfoproteòmica, on vam demostrar que les plantes amb alt contingut de Pi pateixen modificacions substancials en resposta a la infecció per M. oryzae, mentre que les plantes amb baix nivell de Pi van mantenir un nivell basal de fosforilació amb infecció i sense. Per a la Secció 4, explorem la participació del gen OsPBZ1 a la resposta de defensa. Descobrim que OsPBZ1 exerceix un paper fonamental en la resposta de defensa de l'arròs a la infecció per patògens, i la seva expressió està influenciada pel contingut de Pi. La mutagènesi d'OsPBZ1 per CRISPR/Cas9 altera la resistència a M. oryzae de manera dependent de Pi, suggerint una interacció complexa entre OsPBZ1, la disponibilitat de Pi i la susceptibilitat. Finalment, a la Secció 5 analitzem els biosensors FRET com una eina per a la detecció de Pi a temps real mitjançant l'observació de cèl·lules vives, mostrant la seva efectivitat al monitoratge dels canvis de Pi induïts per diversos estímuls a les plantes d'arròs. Calen més investigacions per comprendre les interaccions moleculars i les vies de senyalització que involucren la defensa del Pi i l'arròs.

Las plantas se enfrentan constantemente a una serie de factor ambientales, bióticos y abióticos, afectando significativamente al rendimiento de los cultivos. El estrés biótico es causado por organismos como hongos, bacterias o insectos, mientras que el estrés abiótico incluye la salinidad, la sequía o la disponibilidad de nutrientes. Dada su naturaleza inmóvil, las plantas han desarrollado mecanismos intrínsecos para afrontar estos estreses, mediante la activación de vías de transducción de señales y la reprogramación transcripcional de la expresión genética. En la naturaleza, las plantas se enfrentan continuamente a estreses tanto bióticos como abióticos, comprometiendo significativamente su productividad. Las investigaciones se centran en comprender las respuestas de las plantas a un estrés individual, ya que su combinación es compleja por la interferencia entre las vías de señalización. La regulación puede darse a nivel postraduccional mediante la fosforilación proteica. Sin embargo, nuestro conocimiento sobre los eventos de fosforilación involucrados en las vías de señalización inducidas por patógenos y nutrientes sigue siendo limitada. Además, se ha demostrado que el estado nutricional de una planta influye en la resistencia a enfermedades. El fósforo, adquirido del suelo en forma de fosfato inorgánico (Pi), es un nutriente esencial para el crecimiento y desarrollo de las plantas. La baja biodisponibilidad de Pi en suelos representa un factor limitante para el crecimiento de las plantas. En consecuencia, los fertilizantes de Pi se utilizan en la agricultura moderna para optimizar el rendimiento de los cultivos, causando un exceso de Pi en las plantas. A nivel molecular, se estudia cómo las plantas se adaptan a las condiciones limitantes de Pi mediante la Phosphate Starvation Response, aunque hay menos información sobre la respuesta al exceso de Pi. En esta tesis doctoral, investigamos el efecto y el mecanismo del Pi en la respuesta de las plantas de arroz a la infección por patógenos a nivel proteómico, que da lugar a la resistencia/susceptibilidad a enfermedades en el arroz. En la Sección 1 describimos el doble impacto del contenido de Pi en las hojas de arroz tanto en la planta como en el hongo patógeno Magnaporthe oryzae. La acumulación de Pi afectó negativamente la presencia de Pathogenesis-related proteins en la planta, resultando en un fenotipo susceptible. Simultáneamente, hubo un aumento en la expresión de efectores fúngicos. En la Sección 2 se explicó cómo, en plantas con bajo contenido de Pi, el apoplasto de la hoja se enriqueció con proteínas asociadas con defensa, alineándose con la resistencia observada contra M. oryzae. En la Sección 3, se realizó un análisis fosfoproteómico, donde demostramos que las plantas con alto contenido de Pi sufren modificaciones sustanciales en respuesta a la infección por M. oryzae, mientras que las plantas con bajo nivel de Pi mantuvieron un nivel basal de fosforilación con infección y sin ella. Para la Sección 4, exploramos la participación del gen OsPBZ1 en la respuesta de defensa. Descubrimos que OsPBZ1 desempeña un papel fundamental en la respuesta de defensa del arroz a la infección por patógenos, y su expresión está influenciada por el contenido de Pi. La mutagénesis de OsPBZ1 por CRISPR/Cas9 altera la resistencia a M. oryzae de una manera dependiente de Pi, sugiriendo una interacción compleja entre OsPBZ1, la disponibilidad de Pi y la susceptibilidad. Finalmente, en la Sección 5 analizamos los biosensores FRET como una herramienta para la detección de Pi a tiempo real mediante la observación de células vivas, mostrando su efectividad en el monitoreo de los cambios de Pi inducidos por diversos estímulos en las plantas de arroz. Se necesitan más investigaciones para comprender las interacciones moleculares y las vías de señalización que involucran la defensa del Pi y el arroz.

Plants face a constant array of environmental stresses, including biotic and abiotic challenges, which significantly impact crop yields. Biotic stresses originate from living organisms such as fungi, oomycetes, bacteria, viruses, nematodes, insects, and weeds, while abiotic stresses encompass factors like salinity, drought, extreme temperatures, flooding, radiation, nutrient limitations, and heavy metal toxicity. Given their immobile nature, plants have developed intricate mechanisms to confront these stresses, involving the activation of signal transduction pathways and subsequent transcriptional reprogramming of gene expression. In this context, plants in their natural habitat continually grapple with both biotic and abiotic stresses, significantly compromising their productivity. Research efforts have primarily centered on understanding plant responses to individual stressors. When plants experience a combination of stress factors, it can lead to complex outcomes due to crosstalk between the respective signaling pathways. Over the course of evolution, plants have developed intricate mechanisms to combat pathogen infections, resulting in a substantial body of literature and data detailing the transcriptional reprogramming of gene expression in response to pathogen attack. There is also evidence to suggest that plant immune responses can be post-translationally regulated through protein phosphorylation. However, our understanding of the specific proteins and phosphorylation events involved in the crosstalk between pathogen-induced signaling pathways and nutrient signaling in plants remains limited. Furthermore, the nutritional status of a plant has been shown to influence disease resistance. Phosphorus is an essential nutrient for plant growth and development. Plants acquire this nutrient from the soil in the form of inorganic phosphate (Pi). The low bioavailability of Pi in agricultural soils represents a limiting factor for plant growth. Consequently, Pi fertilizers are routinely used in modern agriculture to optimize crop yields, leading to a scenario of Pi excess in many agricultural ecosystems. At the molecular level, a large effort has been made to understand how plants adapt to Pi limiting conditions through the so called Phosphate Starvation Response (PSR). Less information is available on adaptive mechanisms to Pi excess in plants. In this Ph. D. Thesis, we investigated the effect of Pi on the response of rice plants to pathogen infection at the proteomic level, as well as Pi-mediated mechanism underlying disease resistance/ susceptibility in rice. In Section 1 we described the dual impact of phosphate content in rice leaves on both the rice plant and the fungal pathogen M. oryzae. The accumulation of phosphate negatively affected the presence of Pathogenesis-Related (PR) proteins in the plant, leading to susceptibility. Simultaneously, there was an increase in the expression of fungal effectors. Section 2, described how, in Low-Pi plants, the leaf apoplast was enriched with proteins associated with plant defense reactions, aligning with observed resistance against M. oryzae. Further, in Section 3, a phosphoproteomic analysis was conducted, where we showed that High-Pi plants undergo substantial modifications in response to M. oryzae infection, whereas Low-Pi plants maintained a basal level of phosphorylation under both mock and infected conditions. For Section 4, we explored the involvement of OsPBZ1 gene in defense response. We found that OsPBZ1 plays a pivotal role in the rice's defense response to pathogen infection, with its expression being influenced by Pi content. CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of OsPBZ1 alters blast resistance in a Pi-dependent manner, suggesting a complex interplay between OsPBZ1, Pi availability, and susceptibility. Finally, in Section 5 we analyzed FRET-live imaging sensors as a tool for real-time detection of Pi by live cell imaging, showcasing their effectiveness in monitoring phosphate changes induced by various stimuli in rice plants. Further investigations are needed to understand molecular interactions and signaling pathways involving phosphate and rice's defense.