Serum and tissue biomarkers for clinical diagnosis of canine mammary tumours

Abstract

Els tumors mamaris canins (CMT) són càncers naturals que són freqüents en gosses intactes i rars en gossos mascles. La incidència anual reportada és d'aproximadament 198 casos de cada 100.000 gosses, amb aquesta incidència a ser més alta a les regions del món on rarament es practica la esterilització precoç. La causa exacta dels CMT encara es desconeix, tot i que s'han atribuït multitud de factors de risc. La fita del pronòstic en les CMT és un diagnòstic precoç, amb un diagnòstic tardà generalment associat amb baixes taxes de supervivència després del tractament quirúrgic. Malauradament, els CMT poden estar associats a signes clínics inespecífics, cosa que dificulta la detecció precoç per part del propietari o durant els exàmens físics rutinaris. Igual que en l'oncologia humana, els avenços recents realitzats en el diagnòstic de CMT inclouen el descobriment de biomarcadors tant en teixits de la glàndula mamària mitjançant tècniques d'immunohistoquímica com en sang/plasma/sèrum mitjançant altres mètodes moleculars. Fins ara, en oncologia veterinària, només s'han descobert uns quants biomarcadors i s'han normalitzat per al seu ús. Per tant, vam plantejar la hipòtesi que els biomarcadors en el sèrum i el teixit mamari es poden utilitzar en el diagnòstic de CMT. Els objectius del present estudi eren dobles. En primer lloc, es va avaluar el sèrum de gossos femelles en la determinació de biomarcadors adequats per a CMT. Amb aquesta finalitat, es va prendre mostres de sang de 30 gossos femelles i posteriorment es va centrifugar. El sèrum recollit es va analitzar mitjançant microarrays d'anticossos CD dirigits a 90 marcadors de superfície CD i 56 citocines/quimiocines. Es van seleccionar un total de cinc proteïnes CD, a saber, CD20, CD45RA, CD53, CD59 i CD99, a causa de la seva abundància diferencial de proteïnes en relació amb els valors de log FC o els valors p. Aquests es van analitzar més mitjançant tècniques d'immunoblot per validar els resultats de microarrays.CD45RA va mostrar una abundància significativament menor (P <0, 05) en el sèrum obtingut dels individus que presentaven neoplàsia mamària en comparació amb el grup control. En canvi, el CD99 va resultar significativament més abundant en gossos neoplàsics que en pacients sans. Finalment, el CD20 va mostrar una abundància significativament més alta en individus portadors d'un tumor mamari maligne en comparació amb pacients sans, tot i que no es va observar cap expressió diferencial entre tumors malignes i benignes. Es va concloure que tant el CD99 com el CD45RA són indicadors de la presència de tumor mamari, encara que sense diferenciar entre neoplàsia mamària canina maligna i benigna. En segon lloc, el present estudi va tenir com a objectiu avaluar l'expressió gènica de l'ARNm al teixit mamari tant de gosses CMT sanes com diagnosticades mitjançant PCR quantitativa (RT-qPCR). Els gens diana escollits per a aquest estudi van incloure el factor de creixement endotelial vascular A (VEGFa), CD20, receptor de progesterona (PGR), hialuronidasa 1 (HYAL1), lligand de mort programada 1 (PDL1), factor de creixement epidèrmic (EGF), relaxina 2 (RLN2). ), i la metalopeptidasa matricial 3 (MMP3). Amb aquesta finalitat es van analitzar cinquanta-vuit mostres de teixit mamari de gosses, tant sanes (n=3) com que presentaven tumors mamaris (n-58). Els nivells de transcripció dels gens HYAL1, VEGFa, CD20 i PGR van mostrar expressions similars més altes en tumors mamaris benignes i malignes en comparació amb individus sans, mentre que els gens MMP3, EGF, PDL-1 i RLN2 es van trobar a nivells d'expressió més alts en tumors malignes que en els tumors benignes i el grup control. Per tant, es va concloure que els gens HYAL1, VEGF[Alfa], CD20 i PGR són marcadors de la tumorigènesi, mentre que els gens MMP3, EGF, PDL-1 i RLN2 són marcadors de malignitat. Les expressions gèniques de CD20, PGR, EGF, RLN2 i MMP3 estan significativament correlacionades, cosa que suggereix que la combinació d'aquestes molècules pot tenir potencial com a biomarcadors de malignitat en CMT. En conclusió, aquest estudi va demostrar la implicació de proteïnes CD sèriques específiques així com de gens específics expressats al teixit mamari en la detecció d'anomalies tumorals.

Los tumores mamarios caninos (CMT) son cánceres de origen natural, frecuentes en perras intactas y poco frecuentes en perros macho. La incidencia anual reportada es de aproximadamente 198 casos por cada 100.000 perras, y esta incidencia tiende a ser mayor en regiones del mundo donde rara vez se practica la esterilización temprana. Aún se desconoce la causa exacta de los CMT, aunque se han atribuido innumerables factores de riesgo. El hito para el pronóstico en los CMT es el diagnóstico precoz, mientras que el diagnóstico tardío suele asociarse con bajas tasas de supervivencia después del tratamiento quirúrgico. Desafortunadamente, los CMT pueden estar asociados con signos clínicos no específicos, lo que dificulta la detección temprana por parte del propietario o durante los exámenes físicos de rutina. Al igual que en la oncología humana, los avances recientes realizados en el diagnóstico de CMT incluyen el descubrimiento de biomarcadores tanto en tejidos de glándula mamaria mediante técnicas de inmunohistoquímica como en sangre/plasma/suero mediante otros métodos moleculares. Hasta ahora, en oncología veterinaria, sólo se han descubierto y estandarizado para su uso unos pocos biomarcadores. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que los biomarcadores en el suero y el tejido mamario pueden usarse en el diagnóstico de CMT. Los objetivos del presente estudio fueron dobles. En primer lugar, se evaluó el suero de perras para determinar biomarcadores adecuados para las CMT. Para ello se tomaron muestras de sangre de 30 perras y posteriormente se centrifugaron. El suero recolectado se analizó mediante micromatrices de anticuerpos contra CD dirigidas a 90 marcadores de superficie de CD y 56 citocinas/quimiocinas. Se seleccionaron un total de cinco proteínas CD, a saber, CD20, CD45RA, CD53, CD59 y CD99, debido a su abundancia diferencial de proteínas en relación con los valores log FC o los valores p. Estos se analizaron más a fondo utilizando técnicas de inmunotransferencia para validar los resultados de los microarrays.CD45RA mostró una abundancia significativamente menor (P<0,05) en el suero obtenido de los individuos que presentaban neoplasia mamaria en comparación con el grupo control. Por el contrario, CD99 resultó significativamente más abundante en perras neoplásicas que en pacientes sanos. Finalmente, CD20 mostró una abundancia significativamente mayor en individuos portadores de un tumor mamario maligno en comparación con pacientes sanos, aunque no se observó expresión diferencial entre tumores malignos y benignos. Se concluyó que tanto CD99 como CD45RA son indicadores de presencia de tumor mamario, aunque sin diferenciar entre neoplasia mamaria canina maligna y benigna. En segundo lugar, el presente estudio tuvo como objetivo evaluar la expresión génica del ARNm en tejido mamario de perras con CMT sanas y diagnosticadas mediante PCR cuantitativa (RT-qPCR). Los genes diana elegidos para este estudio incluyeron el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGFa), CD20, receptor de progesterona (PGR), hialuronidasa 1 (HYAL1), ligando de muerte programada 1 (PDL1), factor de crecimiento epidérmico (EGF), relaxina 2 (RLN2). ) y metalopeptidasa de matriz 3 (MMP3). Para este propósito se analizaron cincuenta y ocho muestras de tejido mamario de perras, tanto sanas (n=3) como con tumores mamarios (n-58). Los niveles de transcripción de los genes HYAL1, VEGFa, CD20 y PGR mostraron expresiones más altas similares en tumores mamarios benignos y malignos en comparación con individuos sanos, mientras que los genes MMP3, EGF, PDL-1 y RLN2 se encontraron en niveles de expresión más altos en tumores malignos que en individuos sanos. en los tumores benignos y el grupo control. Por tanto, se concluyó que los genes HYAL1, VEGF[Alfa], CD20 y PGR son marcadores de tumorigénesis, mientras que los genes MMP3, EGF, PDL-1 y RLN2 son marcadores de malignidad. Las expresiones genéticas de CD20, PGR, EGF, RLN2 y MMP3 están significativamente correlacionadas, lo que sugiere que la combinación de estas moléculas puede tener potencial como biomarcadores de malignidad en CMT. En conclusión, este estudio demostró la participación de proteínas CD séricas específicas, así como de genes específicos expresados en el tejido mamario, en la detección de anomalías tumorales.

Canine mammary tumours (CMTs) are naturally occurring cancer that it is frequent in intact female dogs, and rare in male dogs. The annual reported incidence is approximately 198 cases of every 100,000 female dogs, with this incidence tending to be higher in regions of the world where early spaying is seldom practised. The exact cause of CMTs is still unknown, even though myriads of risk factors have been attributed. The milestone for prognosis in CMTs is an early diagnosis, with late diagnosis being usually associated with low survival rates after the surgical treatment. Unfortunately, CMTs may be associated with non-specific clinical signs, which makes early detection by the owner, or during routine physical examinations difficult. Like in human oncology, recent advances made in the diagnosis of CMTs include the discovery of biomarkers in both mammary gland tissues by immunohistochemistry techniques and blood/plasma/serum by other molecular methods. So far in veterinary oncology, only a few biomarkers have been discovered and standardized for use. Therefore, we hypothesized that biomarkers in the serum and mammary tissue can be used in the diagnosis of CMTs. The objectives of the present study were two-fold. Firstly, the serum of female dogs was assessed in the determination of suitable biomarkers for CMTs. To this end, blood was sampled from 30 female dogs and subsequently centrifuged. The collected serum was analysed through CD antibody microarrays targeting 90 CD surface markers and 56 cytokines/chemokines. A total of five CD proteins, namely CD20, CD45RA, CD53, CD59, and CD99, were selected due to their differential protein abundance in relation to either log FC values or p-values. These were further analysed utilizing immunoblotting techniques to validate the microarray results. CD45RA showed a significantly lower (P<0.05) abundance in the serum obtained from the individuals presenting mammary neoplasia in comparison to the control group. In contrast, CD99 resulted significantly more abundant in neoplastic female dogs than in healthy patients. Finally, CD20 showed a significantly higher abundance in individuals carrying a malignant mammary tumour in comparison to healthy patients, although no differential expression between malignant and benign tumours was observed. It was concluded that both CD99 and CD45RA are indicators of mammary tumour presence, although without differentiating between malignant and benign canine mammary neoplasia. Secondly, the present study aimed to assess the gene expression mRNA in mammary tissue of both healthy and diagnosed CMT female dogs through quantitative PCR (RT-qPCR). The target genes chosen for this study included vascular endothelial growth factor A (VEGFa), CD20, progesterone receptor (PGR), hyaluronidase 1 (HYAL1), programmed death ligand 1 (PDL1), epidermal growth factor (EGF), relaxin 2 (RLN2), and matrix metallopeptidase 3 (MMP3). Fifty-eight mammary tissue samples from female dogs, both healthy (n=3) and presenting mammary tumours (n-58), were analysed for this purpose. Transcription levels of HYAL1, VEGFa, CD20 and PGR genes showed similar higher expressions in both benign and malignant mammary tumours in comparison to healthy individuals, whereas MMP3, EGF, PDL-1, and RLN2 genes were found at higher expression levels in malignant tumours than in the benign tumours and the control group. Therefore, it was concluded that HYAL1, VEGF[Alfa], CD20 and PGR genes are markers for tumourigenesis, whereas MMP3, EGF, PDL-1, and RLN2 genes are markers for malignancy. Gene expressions for CD20, PGR, EGF, RLN2 and MMP3 are significantly correlated, suggesting that the combination of these molecules may have potential as malignancy biomarkers in CMTs. In conclusion, this study demonstrated the involvement of specific serum CD proteins as well as specific genes expressed in mammary tissue in the detection of tumoural anomalies.