Gene therapy overexpressing Klotho for Amyotrophic Lateral Sclerosis

Abstract

La esclerosi lateral amiotròfica (ELA) és una malaltia neuromuscular devastadora que manca de tractaments efectius. Els mecanismes fisiopatològics que condueixen a la degeneració de les motoneurones (MNs) i la denervació muscular són complexos i variats. La clau per a la millora funcional en l'ELA rau en prevenir el desemparament axonal dels músculs, protegir les MNs i fomentar la reinervació.

[Alfa]-Klotho (KL) és una cronoquina versàtil amb qualitats neuroprotectores i mioregeneratives, gràcies a les seves propietats antioxidants i antiinflamatòries, i a la seva capacitat de promoure la mielinització, protegir contra l'excitotoxicitat i mantenir la ultraestructura i funció mitocondrial. En aquesta tesi, s'ha explorat el potencial terapèutic de la sobreexpressió de KL tant en el sistema nerviós central (SNC) com en el múscul esquelètic en l'ELA. Amb aquest propòsit, primerament es va identificar una disminució dels nivells endògens de les formes secretada i de membrana de KL en aquests teixits en dos models de degeneració de MNs i atrofia muscular. Posteriorment, es van investigar els efectes protectors de totes dues formes de KL contra l'excitotoxicitat aguda induïda per glutamat utilitzant cultius organotípics de medul·la espinal (SCOCs), revelant una protecció completa de les MNs espinals.

Aprofitant els beneficis pleiotròpics de KL, es van dirigir teràpies gèniques basades en vectors virals adenoassociats (AAV) a la medul·la espinal i els músculs esquelètics del model de ratolí SOD1G93A d'ELA per sobreexpressar KL. Mentre que la sobreexpressió en el SNC només té un impacte lleu en la preservació neuromuscular en les femelles, millora la funció motora en tots dos sexes. D'altra banda, augmentar la secreció muscular de KL protegeix les MNs, redueix la reactivitat astrocítica i microglial, i preseerva les unions neuromusculars (NMJ), prevenint així l'atrofia muscular i mantenint la funció neuromuscular. Aquesta intervenció resulta en una millora de la funció locomotora i de la força, un retard en l'inici de la malaltia i una supervivència prolongada. És important destacar que, fins i tot en una etapa simptomàtica, la sobreexpressió muscular de KL frena el declivi neuromuscular i motor progressiu característic dels ratolins SOD1G93A.

Finalment, s'han realitzat estudis de transcriptòmica i proteòmica a la medul·la espinal i els músculs gastrocnemis, elucidant els principals mecanismes subjacents als efectes neuroprotectors de KL en l'ELA. En conclusió, els nostres resultats ofereixen evidència contundent que la secreció de KL en els músculs pot promoure una millora funcional en l'ELA, obrint possiblement un nou camí en el tractament d'aquesta malaltia devastadora.

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neuromuscular devastadora que carece de tratamientos efectivos. Los mecanismos fisiopatológicos que conllevan a la degeneración de las motoneuronas (MNs) y la denervación muscular son complejos y variados. La clave para la mejora funcional en la ELA radica en prevenir el desprendimiento axonal de los músculos, proteger las MNs y fomentar la reinervación.

[Alfa]-Klotho (KL) es una cronoquina versátil con cualidades neuroprotectores y mioregenerativos, debido a sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias, y a su capacidad de promover la mielinización, proteger contra la excitotoxicidad y mantener la ultraestructura y función mitocondrial. En esta tesis, exploramos el potencial terapéutico de la sobreexpresión de KL tanto en el sistema nervioso central (SNC) como en el músculo esquelético en la ELA. Con este propósito, primero identificamos una disminución de los niveles endógenos de las formas secretadas y membranas de KL en estos tejidos en dos modelos de degeneración de MNs y atrofia muscular. Posteriormente, investigamos los efectos protectores de ambas formas de KL contra la excitotoxicidad aguda inducida por glutamato utilizando cultivos organotípicos de médula espinal (SCOCs), revelando una protección completa de las MNs espinales.

Aprovechando los beneficios pleiotrópicos de KL, dirigimos terapias génicas basadas en vectores virales adenoasociados (AAV) a la médula espinal y los músculos esqueléticos del modelo de ratón SOD1G93A de ELA para sobrexpresar KL. Mientras que la sobreexpresión en el SNC sólo tuvo un impacto leve en la preservación neuromuscular en las hembras, mejoró la función motora en ambos sexos. Por otro lado, aumentar la secreción muscular de KL protegió las MNs, redujo la reactividad astrocítica y microglial, y preservó las uniones neuromusculares (NMJ), previniendo así la atrofia muscular y manteniendo la función neuromuscular. Esta intervención resultó en una mejora de la función locomotora y de la fuerza, un retraso en el inicio de la enfermedad y una supervivencia prolongada. Es importante destacar que, incluso en una etapa sintomática, la sobreexpresión muscular de KL ralentizó el declive neuromuscular y motor progresivo característico de los ratones SOD1G93A.

Finalmente, realizamos estudios de transcriptómica y proteómica en la médula espinal y los músculos gastrocnemios, elucidando los principales mecanismos subyacentes a los efectos neuroprotectores de KL en la ELA. En conclusión, nuestros hallazgos ofrecen evidencia convincente de que la secreción de KL en los músculos puede promover una mejora funcional en la ELA, abriendo posiblemente un nuevo camino en el tratamiento de esta devastadora enfermedad.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a debilitating neuromuscular disease currently lacking effective treatments. The pathophysiological mechanisms involved in the degeneration of motoneurons (MNs) and muscle denervation are intricate and diverse. The key to enhancing functional outcomes in ALS lies in preventing axonal detachment from muscles, protecting MNs, and promoting reinnervation.

[Alfa]-Klotho (KL) emerges as a pleiotropic chronokine with notable neuroprotective and myoregenerative properties, including anti-oxidative and anti-inflammatory effects, promoting myelination, protecting from excitotoxicity, and maintaining mitochondrial ultrastructure and function. In the present thesis, we have explored the therapeutic potential of KL overexpression in both the central nervous system and skeletal muscle in ALS. For this purpose, we first identified that the endogenous levels of secreted and transmembrane KL in these tissues were downregulated in two models of MN degeneration and muscle atrophy. Next, we investigated the protective effects of secreted and transmembrane KL against acute excitotoxicity using spinal cord organotypic cultures (SCOCs), revealing complete protection of spinal MNs from glutamate-induced excitotoxicity upon KL overexpression.

Capitalizing on the pleiotropic benefits of KL, we employed gene therapies based on adeno-associated viral vectors (AAV) to overexpress secreted KL in the spinal cord and skeletal muscles of the SOD1G93A mouse model of ALS. Our results indicate that CNS overexpression had a mild impact on neuromuscular preservation, only observed in females, but it improved motor function in both sexes. On the other hand, enhancing muscle secretion of KL protected MNs, mitigated astrocyte and microglial reactivity, and preserved neuromuscular junctions (NMJ). This intervention resulted in preserved muscle mass and neuromuscular function, improved locomotor function and strength, delayed disease onset, and prolonged survival. Importantly, even at a symptomatic stage, muscle overexpression of KL slowed down the progressive neuromuscular and motor decline characteristic of SOD1G93A mice.

Finally, we conducted comprehensive transcriptomics and proteomics in the spinal cord and gastrocnemius muscles, elucidating the primary mechanisms underlying the neuroprotective effects of KL in ALS. Overall, our findings offer compelling evidence that muscle secretion of KL can foster functional improvement in ALS, potentially paving the way for a novel avenue in the treatment of this devastating disorder.