Enhancing CAR-T Cell Therapy for Hematological Malignancies through Dual Targeting and Combination with NK Cells

Abstract

[eng] CAR-T therapy has represented a milestone for the treatment of hematological patients in relapse or refractory to conventional treatments, leading to the approval by regulatory agencies of four CAR-T products against CD19 for the treatment of patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) or non-Hodgkin lymphoma (NHL), and two CAR-T products against BCMA for the treatment of multiple myeloma (MM). Despite promising response rates, some patients have been observed to relapse after CAR- therapy T. The main escape mechanisms vary depending on the disease. In NHL, most patients relapse with loss of antigenic target or decreased antigen levels, while in MM, it is mainly due to the lack of persistence of CAR-T cells. The main objective of this thesis is to prevent these mechanisms of resistance to CAR-T therapy through two projects, one focused on NHL and the other on MM. On the one hand, we hypothesized that the generation of dual CAR-T cells, directed against CD19 and BCMA antigens, could decrease selective pressure on a single antigen and improve CAR-T therapy in NHL. On the other hand, we hypothesize that the combination of CAR-T cells against BCMA with other immune cells such as NK cells derived from umbilical cord blood, could improve their antitumor efficacy synergistically. As CAR constructs, we used ARI0001 (CAR-CD19) and ARI0002h (CAR-BCMA), both academically developed at the Hospital Clínic de Barcelona. In the first part, different dual CAR-T strategies are developed: 1) co-transduction with two lentiviral vectors, 2) Mixture of monospecific CAR-T cells, 3) bicistronic lentiviral vector that codes for both CARs, 4) a single CAR receptor with dual specificity with two extracellular domains in tandem or loop conformation. For in vitro models, different tumor lines representative of the hematological diseases of interest are used.

For in vivo models, immunosuppressed mice (NSG) are used in which a systemic model of disease is developed through intravenous injection of tumor cells for subsequent treatment. First, it was found that co-transduction (ARI0003) is the dual strategy that allows us to have CAR-T cells with better expression of membrane CAR receptors compared to the bicistronic, tandem and loop strategy. In addition, co-transduced cells are especially effective in models with low CD19 antigen expression, both in vitro and in vivo. This set of preclinical results has been submitted to the Spanish Agency for Medicines and Medical Devices to request approval for a clinical trial to test ARI0003 in patients with NHL, including those who relapsed after receiving a CD19-directed CAR-T. In a second part, we demonstrated that the combination between CAR-T BCMA and cord NK cells increased antitumor efficacy in MM models, achieving synergistic activity between both immune cells, especially at early times. In the presence of NK cells, CAR-T cells migrated more rapidly to tumor cells forming attack clusters earlier, thus eliminating tumor cells more efficiently. In addition, we observed a lower expression of markers of depletion in the presence of NK cells, suggesting that the combination of CAR-T cells with NK could reduce the depletion of CAR-T cells.

[spa] La terapia CAR-T ha representado un hito para el tratamiento de pacientes hematológicos en recaída o refractarios a tratamientos convencionales, dando lugar a la aprobación por las agencias reguladoras de cuatro productos CAR-T contra CD19 para el tratamiento de pacientes con leucemia aguda linfoblástica (LAL) o linfoma no Hodgkin (LNH), y dos productos CAR-T contra BCMA para el tratamiento de mieloma múltiple (MM). A pesar de las prometedoras tasas de respuesta, se ha observado que algunos pacientes recaen tras la terapia CAR- T. Los mecanismos de escape mayoritarios varían según la enfermedad. En LNH, la mayoría de pacientes recaen con pérdida de diana antigénica o niveles disminuidos de antígeno, mientras que, en MM, se debe sobre todo a la falta de persistencia de las células CAR-T. El objetivo principal de esta tesis es prevenir estos mecanismos de resistencia a la terapia CAR-T a través de dos proyectos, uno centrado en LNH y otro en MM. Por una parte, hipotetizamos que la generación de células CAR-T duales, dirigidas contra los antígenos CD19 y BCMA, podría disminuir la presión selectiva sobre un solo antígeno y mejorar la terapia CAR-T en LNH. Por otra parte, hipotetizamos que la combinación de células CAR-T contra BCMA con otras células inmunes como las células NK derivadas de sangre de cordón umbilical, podría mejorar su eficacia antitumoral de manera sinérgica. Como constructos CAR, utilizamos ARI0001 (CAR-CD19) y ARI0002h (CAR-BCMA), ambos desarrollados académicamente en el Hospital Clínic de Barcelona. En una primera parte, se desarrollan diferentes estrategias CAR-T duales: 1) co- transducción con dos vectores lentivirales, 2) Mezcla de células CAR-T monoespecificas, 3) vector lentiviral bicistrónico que codifica para ambos CARs, 4) un solo receptor CAR con especificidad dual con dos dominios extracelulares en conformación tándem o loop. Para los modelos in vitro se utilizan diferentes líneas tumorales representativas de las enfermedades hematológicas de interés.

Para los modelos in vivo se utilizan ratones inmunodeprimidos (NSG) en los que se desarrolla un modelo sistémico de enfermedad a través de inyección intravenosa de las células tumorales para su posterior tratamiento. Primero, se encontró que la co-transducción (ARI0003) es la estrategia dual que nos permite tener células CAR-T con una mejor expresión de los receptores CAR en membrana en comparación con la estrategia de bicistronic, tándem y loop. Además, las células co-transducidas son especialmente efectivas en modelos con baja expresión antigénica de CD19, tanto in vitro como in vivo. Este conjunto de resultados preclínicos se ha presentado a la Agencia Española de Medicamentos y Productos sanitarios para solicitar la aprobación de un ensayo clínico para testar el ARI0003 en pacientes con LNH, incluyendo aquellos recaídos tras recibir un CAR-T dirigido a CD19. En una segunda parte, demostramos que la combinación entre CAR-T BCMA y células NK de cordón aumentaba la eficacia antitumoral en modelos de MM, logrando una actividad sinérgica entre ambas células inmunes, especialmente a tiempos tempranos. En presencia de células NK, las células CAR-T migraron más rápidamente a las células tumorales formando clústers de ataque de forma más temprana, eliminando así a las células tumorales más eficientemente. Además, observamos una menor expresión de marcadores de agotamiento en presencia de células NK, sugiriendo que la combinación de células CAR-T con NK podría reducir el agotamiento de las células CAR-T.