Hemocyanin's study from a chemical point of view

Abstract

Després de l'evolució dels primers organismes pluricel·lulars, la Natura ha proporcionat tres tipus principals de transportadors d'oxigen presents als organismes vius: Hemoglobina (Hb), Hemeritrina (Hr) i Hemocianina (Hc). L'hemocianina és coneguda com el pigment respiratori present en diversos mol·luscs i artròpodes que permet la captació i posterior utilització de l'oxigen. Això és possible gràcies a la presència d'un centre binuclear de coure en el centre actiu (proteïna de coure de tipus-3), a la part interna de la proteïna. Cada àtom de Cu està envoltat de tres histidines (His) i cada centre actiu pot fixar reversiblement una molècula d'O2 formant un pont, inusual, de peròxid. A causa d'aquesta unió reversible es produeix una transició entre dos estats diferents de la proteïna: Deoxy-Hc i Oxy-Hc, que es realitza mitjançant una reacció redox en què el Cu(I) de la forma Deoxy-Hc s'oxida a Cu (II) (Oxy-Hc) i l'O2 es redueix a O22-. Cada estat ofereix prou trets característics per ser fàcilment identificat. Recentment, ens hem centrat a l'Hc de Cantareus aspersum. En aquesta mena de gasteròpode, la Hc consisteix en un didecàmer cilíndric amb una massa molecular de 8000 kDa. Cada decàmer està compost per cinc dímers de subunitats, i cada subunitat, que té una massa molecular de 400 kDa, està formada per 8 unitats funcionals (FU). Cada FU conté un centre binuclear de coure capaç d'unir una molècula de O2. Els gasteròpodes, i especialment els cargols, tenen dues isoformes de metal·lotioneïna (MT): una específica pel Cd (CdMT), i una per al Cu (CuMT). Diversos estudis bibliogràfics suggereixen que la Hc i la CuMT se sintetitzen a les cèl·lules dels rogòcits i això ha donat lloc a la hipòtesi que pot existir una relació entre la Hc i la CuMT en què aquesta última podria ser la font de Cu(I ) per a la Hc naixent. L'objectiu principal d'aquest projecte és esbrinar la implicació de les metal·lotioneïnes específiques de Cu (CuMTs) com a font de Cu(I) a la síntesi de la Hc al cargol Cantareus aspersum. Per assolir aquest objectiu, s'han utilitzat diverses tècniques analítiques per caracteritzar el comportament, l'estructuració i la composició de les diferents preparacions: espectroscòpia UV-Vis, espectroscòpia de fluorescència, SEC, TEM i ICP-OES. A més, s'han dissenyat diversos experiments amb l'objectiu de i) obtenir la forma apo-Hc i estudiar-ne el procés de reconstitució, primer mitjançant una transferència directa d'ions Cu(I) i després, amb una transferència de Cu(I) des de la CuMT, i ii) determinar com afecten les diferents etapes vitals dels cargols i la dieta que tenen a l'estat de la Hc d'aquests organismes.

Tras la evolución de los primeros organismos pluricelulares, la Naturaleza ha proporcionado tres tipos principales de transportadores de oxígeno presentes en los organismos vivos: Hemoglobina (Hb), Hemeritrina (Hr) y Hemocianina (Hc). La hemocianina es conocida como el pigmento respiratorio presente en varios moluscos y artrópodos que permite la captación y posterior utilización del oxígeno. Esto es posible gracias a la presencia de un centro binuclear de cobre en el centro activo (proteína de cobre de tipo-3), en la parte interna de la proteína. Cada átomo de Cu está rodeado por tres histidinas (His) y cada centro activo puede fijar reversiblemente una molécula de O2 formando un puente, inusual, de peróxido. Debido a esta unión reversible se produce una transición entre dos estados diferentes de la proteína: Deoxy-Hc y Oxy-Hc, que se realiza mediante una reacción redox en la que el Cu(I) de la forma Deoxy-Hc se oxida a Cu(II) (Oxy-Hc) y el O2 se reduce a O22-. Cada estado ofrece suficientes rasgos característicos para ser fácilmente identificado. Recientemente, nos hemos centrado en el Hc de Cantareus aspersum. En esta especie de gasterópodo, la Hc consiste en un didecámero cilíndrico con una masa molecular de 8000 kDa. Cada decámero está compuesto por cinco dímeros de subunidades, y cada subunidad, que tiene una masa molecular de 400 kDa, está formada por 8 unidades funcionales (FU). Cada FU contiene un centro binuclear de cobre, capaz de unir una molécula de O2. Los gasterópodos, y especialmente los caracoles, tienen dos isoformas de metalotioneína (MT): una CdMT que es Cd-específica, y una CuMT para el Cu. Varios estudios bibliográficos sugieren que la Hc y la CuMT se sintetizan en las células de los rogocitos y esto ha dado lugar a la hipótesis de que puede existir una relación entre la Hc y la CuMT en la que esta última podría ser la fuente de Cu(I) para la Hc naciente. El objetivo principal de este proyecto es averiguar la implicación de las metalotioneínas específicas de Cu (CuMTs) como fuente de Cu(I) en la síntesis de la Hc en el caracol Cantareus aspersum. Para lograr este objetivo, se han utilizado varias técnicas analíticas para caracterizar el comportamiento, la estructuración y la composición de las diferentes preparaciones: espectroscopia UV-Vis, espectroscopia de fluorescencia, SEC, TEM e ICP-OES. Además, se han diseñado varios experimentos con el objetivo de i) obtener la forma apo-Hc y estudiar su proceso de reconstitución, primero mediante una transferencia directa de iones Cu(I) y después, con una transferencia de Cu(I) desde la CuMT, y ii) determinar cómo afectan las distintas etapas vitales de los caracoles y su dieta al estado de Hc de estos organismos.

After the evolution of the first pluricellular organisms, Nature has provided three main types of oxygen transporters present in the living organisms: Hemoglobin (Hb), Hemerythrin (Hr) and Hemocyanin (Hc). Hemocyanin is known as the respiratory pigment present in several mollusks and arthropods that allows the caption and further use of oxygen. This is possible due to the presence of di-copper center in the active site (Type-3 copper protein), at the inner part of the protein. Each Cu atom is surrounded by three histidines (His) and each active site can reversibly bind one molecule of O2 forming an unusual peroxide bridge. Due to this reversible binding there is a transition between two different states of the protein: Deoxy-Hc and Oxy-Hc, which is performed through a redox reaction where the Cu(I) of Deoxy-Hc is oxidized to Cu(II) (Oxy-Hc) and O2 is reduced to O22-. Each state offers enough characteristic features to be easily identified. Recently, we have focused on the Hc of Cantareus aspersum. In this Gastropoda species, Hc consists on a cylindrical didecamer with a molecular mass of 8000 kDa. Each decamer is composed by five dimers of subunits, and each subunit, which has a molecular mass of 400 kDa, is made of 8 functional units (FUs). Each FU contains one di-copper center, able to bind one O2 molecule. Gastropoda, and specially snails, have two metallothionein (MT) isoforms: a CdMT which is Cd-specific, and a CuMT for Cu. Several literature studies suggest that Hc and CuMT are synthesized in the rhogocyte cells and this has given rise to the hypothesis that there can be a relationship between Hc and CuMT in which the latter could be the source of Cu(I) for the nascent Hc. The main objective of this project is to ascertain the involvement of Cu-specific metallothioneins (CuMTs) as the source of Cu(I) in the synthesis of Hemocyanin (Hc) in the snail Cantareus aspersum. To achieve this goal, several analytical techniques have been used to characterize the behavior, structuration and composition of the different preparations: UV-Vis spectroscopy, fluorescence spectroscopy, SEC, TEM and ICP-OES. Moreover, several experiments have been designed with the aim of i) obtaining the apo-Hc form and studying its reconstitution process, first through a direct transfer of Cu(I) ions and afterwards, with a Cu(I) transfer from the CuMT, and ii) determining how the different life stages of the snails and their diet affect the Hc status of these organisms.