In vitro diagnostic designs for applications in health care

Abstract

L'interès creixent per noves proves in vitro es justifica per la necessitat de nous diagnòstics ràpids específics i sensibles. Aquesta demanda s'ha tornat especialment important en resposta a l'augment de la prevalença de malalties emergents. L'objectiu d'aquesta tesi és, doncs, explorar l'ús de diferents biomarcadors per al disseny de proves in vitro en aplicacions per a l'atenció mèdica, incloent malalties tant infeccioses com no infeccioses. Actualment, hi ha diverses estratègies comercials per a la seva detecció, però el seu alt cost, instrumentació especialitzada i procediments complexos en dificulten l'accessibilitat en centres d'atenció primària. Per tant, sorgeix la necessitat de desenvolupar mètodes de detecció alternatius basats en nous biomarcadors per al diagnòstic primerenc. Aquesta tesi se centra a explorar diferents biomarcadors: els microRNAs (miRNAs), el RNA missatger (mRNA) i els exosomes. En ella s'han desenvolupat mètodes de detecció específics per a cada biomarcador, utilitzant biòpsies líquides i partícules magnètiques, que han permès procediments mínimament invasius per a la recol·lecció de mostres i han simplificat el protocol en reduir la complexitat dels equips usats. A més, el rendiment analític també ha millorat en preconcentrar l'analit i minimitzar l'efecte de la matriu. La primera aproximació s'ha centrat en els miRNAs com a biomarcadors per a la detecció de càncer. S'ha desenvolupat un assaig competitiu de miRNA magnetic enzimàtic per detectar els miRNA21 i miRNA27a dins dels exosomes, coneguts per tenir un augment en la seva expressió en el càncer de mama. La segona aproximació explora l'RNA missatger de l'interferó gamma per avaluar la resposta immune cel·lular, especialment rellevant durant la pandèmia de SARS-CoV-2. En aquest assaig, es va aconseguir reduir el temps d'incubació al mesurar els nivells d'mRNA en comptes de les proteïnes secretades. Aquest mètode, provat amb la infecció per SARS-CoV-2, simplifica l'avaluació i podria ajudar al pronòstic. La tercera aproximació investiga els exosomes derivats de neurones per al diagnòstic primerenc de la malaltia d'Alzheimer. Per això s'ha desenvolupat un immunoassaig magnètic per a proteïnes de membrana, utilitzant biomarcadors específics de neurones i la detecció de la proteïna beta-secretasa. Totes les estratègies estudiades en aquesta tesi apropen els diagnòstics als centres datenció primària i entorns amb recursos limitats. En resum, la tesi té com a objectiu contribuir al desenvolupament de plataformes in vitro per a la quantificació de tot tipus de biomarcadors, que es poden adaptar fàcilment a desafiaments emergents. Aquesta característica podria ser particularment interessant amb l'arribada d'una altra pandèmia, on el desenvolupament ràpid de noves estratègies de diagnòstic podria ser necessari.

El creciente interés por nuevas pruebas in vitro se justifica por la necesidad de nuevos diagnósticos rápidos específicos y sensibles. Esta demanda se ha vuelto particularmente importante en respuesta al aumento de la prevalencia de enfermedades emergentes. Por lo tanto, el objetivo de esta tesis es explorar el uso de diferentes biomarcadores para el diseño de pruebas in vitro en aplicaciones para la atención médica, incluyendo enfermedades tanto infecciosas como no infecciosas. Actualmente, existen diversas estrategias comerciales para su detección, pero su alto precio, instrumentación especializada y procedimientos complejos dificultan su accesibilidad en centros de atención primaria. Por lo tanto, surge la necesidad de desarrollar métodos alternativos de detección basados en biomarcadores novedosos para el diagnóstico temprano. Esta tesis se centra en explorar diferentes biomarcadores: los microRNAs (miRNAs), el RNA mensajero (mRNA) y los exosomas. Se han desarrollado métodos de detección específicos para cada biomarcador, utilizando biopsias líquidas y partículas magnéticas, que han permitido procedimientos mínimamente invasivos para la recolección de muestras y han simplificdo el protocolo al reducir la complejidad de los equipos usados. Además, el rendimiento analítico también se mejora al preconcentrar el analito y minimizar el efecto de la matriz. La primera aproximación se centra en los miRNAs como biomarcadores para la detección de cáncer. Se ha desarrollado un ensayo competitivo de miRNA magneto enzimático para detectar los miRNA21 y miRNA27a dentro de los exosomas, conocidos por tener un incremento en su expresión en el cáncer de mama. La segunda aproximación explora el RNA mensajero del interferón gamma para evaluar la respuesta inmune celular, especialmente relevante durante la pandemia de SARS-CoV-2. En este ensayo, se logró reducir el tiempo de incubación al medir los niveles de mRNA en lugar de las proteínas secretadas. Este método, probado con la infección por SARS-CoV-2, simplifica la evaluación y podría ayudar en el pronóstico. La tercera aproximación investiga los exosomas derivados de neuronas para el diagnóstico temprano de la enfermedad de Alzheimer. Para ello se ha desarrollado un inmunoensayo magnético para proteínas de membrana, utilizando biomarcadores específicos de neuronas y la detección de la proteína beta-secretasa. Todas las estrategias estudiadas en esta tesis acercan los diagnósticos a los centros de atención primaria y entornos con recursos limitados. En resumen, la tesis tiene como objetivo contribuir al desarrollo de plataformas in vitro para la cuantificación de todo tipo de biomarcadores, que pueden adaptarse fácilmente a desafíos emergentes. Esta característica podría ser particularmente significativa con la llegada de otra pandemia, donde el rápido desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico podría ser necesario.

The growing interest for novel in vitro testing is highlighted by the need for novel specific and sensitive rapid diagnostic. This demand has become particularly important in response to the rising prevalence of emerging diseases. Thereby, the aim of this thesis is exploring the use of different biomarkers for in vitro diagnostic designs in healthcare applications, including both communicable and non-communicable diseases. Currently, various approaches are commercially available, but their high cost, benchtop instrumentation, and complex procedures hinder their accessibility in point-of-care facilities. Therefore, there is a need for the development of alternative detection methods based on novel biomarkers for early diagnosis. This thesis is focused on different biomarkers: microRNAs (miRNAs), messenger RNA (mRNA), and exosomes. Specific detection methods were developed for each biomarker, utilizing liquid biopsies and magnetic particles. These allow minimally invasive procedures for sample collection and simplify the protocol, by reducing the complexity of the equipment. Moreover, the analytical performance is also improved by preconcentrating the analyte and minimizing the matrix effect. The first approach focuses on miRNAs as biomarkers for cancer detection. A competitive magneto enzyme-linked miRNA assay was developed to detect miRNA21 and miRNA27a within exosomes, known to be upregulated in breast cancer. The second approach explores interferon gamma mRNA for evaluating cellular immune response, particularly relevant during the SARS-CoV-2 pandemic. A shortened assay time was achieved by measuring mRNA levels instead of protein. This method, tested with SARS-CoV-2 infection, simplifies evaluation, and could aid in prognosis. The third approach investigates neuro-derived exosomes for early Alzheimer's disease diagnosis. A magneto-actuated immunoassay targeting membrane proteins was developed, utilizing neuron-specific biomarkers and beta-secretase detection. All the strategies studied in this thesis brings diagnostics closer to primary healthcare facilities and resource-constrained settings. To summarize, this thesis aims at contributing to the development of in vitro platform for the quantification of all types of biomarkers, which can be easily switched to emerging challenges. This feature could be particularly significant with the advent of another pandemic, wherein the rapid development of new diagnostic strategies could be imperative.