Chromosome bridge resolution: Unravelling cell-cycle-dependent mechanisms of biochemical and mechanical nature

Abstract

Els pont cromosòmics són un intermediari comú als mecanismes que generen inestabilitat cromosòmica. Tot i que se sap que els ponts cromosòmics estan implicats en la tumorogènesi i la progressió tumoral, els processos que en regeixen la resolució segueixen sent poc coneguts. Han sorgit diversos models en quant a la seva resolució; tanmateix, aquests models entren en conflicte entre ells. Aquesta tesi cerca desxifrar els mecanismes involucrats en la resolució de ponts cromosòmics. La nostra investigació demostra que els ponts cromosòmics poden trencar-se tant durant la divisió cel·lular com durant la interfase, per diferents mecanismes que governen el seu trencament a cada etapa del cicle cel·lular. En aquesta tesi, hem fet servir un model experimental basat en la tecnologia CRISPR/Cas9 per generar ponts cromosòmics de geometria definida sota un control temporal exquisit. El nostre estudi ha revelat que al final de la mitosi, la resolució dels ponts cromosòmics està estretament relacionada amb les forces de tensió exercides pels microtúbuls del fus mitòtic sobre els cinetocors del pont. Durant la mitosi, la longitud de la cromatina del pont en megabases influeix tant en el moment de trencament com en la separació mínima entre els cinetocors del pont necessària per al trencament del pont. Després de la mitosi, l'endonucleasa ANKLE1 contribueix a la resolució dels ponts cromosòmics, ja que la seva inhibició provoca un augment de la freqüència dels ponts cromosòmics que arriben a la interfase del cicle cel·lular. En particular, descobrim que ANKLE1 també pot resoldre ponts durant la interfase primerenca sense necessitat de trencar l'embolcall nuclear. Per contra, un mecanisme addicional que opera durant la interfase es basa en la ruptura de l'embolcall nuclear. Els contactes focals que ancoren el pont al substrat combinats amb la migració cel·lular donen com a resultat el trencament de l'ADN i la ruptura de l'embolcall nuclear, cosa que permet l'accés a exonucleases citoplasmàtiques, com ara TREX1 per a la resolució de ponts cromosòmics en aquesta etapa del cicle cel·lular. En conjunt, les troballes presentades en aquesta tesi doctoral demostren que els ponts cromosòmics es poden trencar en diferents etapes al llarg del cicle cel·lular, revelant un conjunt de mecanismes que governen el trencament dels ponts cromosòmics.

Los puente cromosómicos son un intermediario común en los mecanismos que generan inestabilidad cromosómica. Aunque se sabe que los puentes cromosómicos están implicados en la tumorogénesis y la progresión tumoral, los procesos que rigen su resolución siguen siendo poco conocidos. Han surgido diversos modelos en cuanto a su resolución; sin embargo, estos modelos entran en conflicto entre sí. Esta tesis busca descifrar los mecanismos involucrados en la resolución de puentes cromosómicos. Nuestra investigación demuestra que los puentes cromosómicos pueden romperse tanto durante la división celular como durante la interfase, por diferentes mecanismos que gobiernan su rotura en cada etapa del ciclo celular. En esta tesis, hemos utilizado un modelo experimental basado en la tecnología CRISPR/Cas9 para generar puentes cromosómicos de geometría definida bajo un control temporal exquisito. Nuestro estudio reveló que al final de la mitosis, la resolución de los puentes cromosómicos está estrechamente relacionada con las fuerzas de tensión ejercidas por los microtúbulos del huso mitótico sobre los cinetocoros del puente. Durante la mitosis, la longitud de la cromatina del puente en megabases influye tanto en el momento de rotura como en la separación mínima entre los cinetocoros del puente necesaria para la rotura del puente. Después de la mitosis, la endonucleasa ANKLE1 contribuye a la resolución de los puentes cromosómicos, ya que su inhibición provoca un aumento de la frecuencia de los puentes cromosómicos que llegan a la interfase del ciclo celular. En particular, descubrimos que ANKLE1 también puede resolver puentes durante la interfase temprana sin necesidad de romper la envoltura nuclear. Por el contrario, un mecanismo adicional que opera durante la interfase se basa en la ruptura de la envoltura nuclear. Los contactos focales que anclan el puente al sustrato combinados con la migración celular dan como resultado la rotura del ADN y la ruptura de la envoltura nuclear, lo que permite el acceso a exonucleasas citoplasmáticas, como TREX1 para la resolución de puentes cromosómicos en esta etapa del ciclo celular. En conjunto, los hallazgos presentados en esta tesis doctoral demuestran que los puentes cromosómicos pueden romperse en diferentes etapas a lo largo del ciclo celular, revelando un conjunto de mecanismos que gobiernan la rotura de los puentes cromosómicos.

Chromosome bridge is a common intermediate in mechanisms generating chromosomal instability. Although chromosome bridges are known to be involved in tumorogenesis and tumor progression, the processes governing their resolution remain poorly understood. Diverse models have emerged regarding their resolution; however, these models are conflicting with one another. This dissertation seeks to elucidate the mechanisms involved in chromosome bridge resolution. Our research demonstrates that chromosome bridges can undergo breakage during both cell division and interphase, with different mechanisms governing their breakage at each stage of the cell cycle. In this thesis, we have used an experimental model based on the CRISPR/Cas9 technology to generate chromosome bridges with defined geometry under exquisite temporal control. Our study revealed that at the exit of mitosis, the resolution of chromosome bridges is intricately linked to the tension forces exerted by the microtubules of the mitotic spindle on the bridge kinetochores. At the exit of mitosis, the length of the bridging chromatin in megabases influences both the timing and the minimum separation between bridge kinetochores needed for bridge breakage. After mitosis, the endonuclease ANKLE1 contributes to the resolution of chromosome bridges as its inhibition led to an increased frequency of chromosome bridges arriving to the interphase of the cell cycle. Notably, we found that ANKLE1 can also resolve bridges during early interphase without necessitating nuclear envelope rupture. Conversely, an additional mechanism that operates during interphase relies on nuclear envelope rupture. Focal adhesions anchoring the bridge to the substrate combined with cell migration results in DNA breakage and nuclear envelope rupture, allowing access to cytoplasmic exonucleases, such as TREX1 for the resolution of chromosome bridges at this stage of the cell cycle. Altogether, the findings presented in this doctoral dissertation demonstrate that chromosome bridges can undergo breakage at different stages throughout the cell cycle, revealing a diverse and distinctive set of mechanisms governing chromosome bridge breakage.