Novel chronokine-based approaches to tackle multiple pathways in Alzheimer’s disease: secreted Klotho and newly designed chimeric HEBE

Abstract

La malaltia d'Alzheimer és la forma més comuna de demència a tot el món. Aquest trastorn neurodegeneratiu es caracteritza per l'acumulació de proteïnes β-amiloide i Tau al cervell, juntament amb vies i processos cel·lulars desregulats. Malgrat les nombroses estratègies terapèutiques proposades, no s'ha aprovat cap tractament definitiu per curar o prevenir l'Alzheimer a causa de la seva naturalesa multifacètica, fent que les estratègies d'una sola diana siguin ineficaces. Per tant, les proteïnes pleiotrópiques com les cronoquines ofereixen una potencial alternativa per a una teràpia efectiva contra l'Alzheimer. Les cronoquines són proteïnes que determinen funcions sistèmiques i processos d'envelliment biològic, i poden emprar-se per desenvolupar una teràpia que combati el deteriorament cognitiu observat en l'Alzheimer.

Klotho és una proteïna pleiotrópica que té un important paper antienvelliment i neuroprotector al cervell. La isoforma secretada (sKL) ha demostrat millorar la cognició i la memòria en ratolins envellits. La disminució en l'expressió de sKL amb l'edat o en la patologia de l'Alzheimer la posiciona com una candidata terapèutica prometedora per a l'Alzheimer.

En la present tesi, es va provar l'administració sistèmica de sKL humà recombinant en un model de ratolí amb Alzheimer. Ratolins APP/Tau de cinc mesos van rebre injeccions intraperitoneals diàries de sKL recombinant durant 6 setmanes. El tractament amb sKL no va afectar el pes ni l'activitat locomotora dels ratolins amb Alzheimer. Malgrat el fenotip relativament lleu d'Alzheimer en els ratolins, especialment entre les femelles, es va observar una modesta millora en la memòria de reconeixement en els ratolins mascles amb Alzheimer després del tractament amb sKL. L'anàlisi transcriptòmic va suggerir que aquesta millora cognitiva podria involucrar una major neurotransmissió de glutamat, tot i que el mecanisme precís continua sent poc clar a causa de la incapacitat de sKL per travessar la barrera hematoencefàlica.

Malgrat les propietats pleiotrópiques de sKL, podria no ser suficient com a tractament independent per a l'Alzheimer. En conseqüència, una combinació de diverses cronoquines podria representar una estratègia terapèutica més potent. En la present tesi es va dissenyar una nova cronoquina quimèrica, HEBE, integrant els efectes neuroprotectors de sKL, les millores en la funció microglial de sTREM2 i la promoció de la diferenciació neuronal i la densitat sinàptica de TIMP2. Les proves in vitro d'HEBE van revelar noves funcions derivades de la combinació de les proteïnes, tot i que la subunitat TIMP2 en HEBE no va poder inhibir les MMPs. Posteriorment, HEBE es va avaluar in vivo mitjançant teràpia gènica utilitzant un vector AAV9P31 en ratolins APP/Tau de 24 setmanes d'edat, i es van dur a terme proves de comportament i cognitives a les 36 setmanes d'edat. Els ratolins amb Alzheimer van mostrar un fenotip marcat, i HEBE va millorar significativament la memòria de reconeixement i l'aprenentatge espacial, sense efectes tòxics. Aquestes millores van coincidir amb una reducció de les acumulacions de pTau a l'hipocamp i modestes millores transcripcionals a l'hipocamp i còrtex entorrinal.

També es va generar una segona versió d'HEBE, anomenada HEBE2, per superar la manca d'inhibició de MMP per part de TIMP2 en HEBE, i per aconseguir una expressió més sostinguda de la proteïna mitjançant la modificació del promotor. Futurs estudis avaluaran l'eficàcia de HEBE2 in vitro i in vivo per determinar el seu potencial per millorar els resultats funcionals en comparació amb HEBE.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la forma más común de demencia en todo el mundo. Este trastorno neurodegenerativo se caracteriza por la acumulación de proteínas β-amiloide y Tau en el cerebro, junto con vías y procesos celulares desregulados. A pesar de las numerosas estrategias terapéuticas propuestas, no se ha aprobado ningún tratamiento definitivo para curar o prevenir la EA debido a su naturaleza multifacética, haciendo que las estrategias de una sola diana sean ineficaces. Por lo tanto, las proteínas pleiotrópicas como las cronoquinas ofrecen una potencial alternativa para una terapia efectiva contra la EA. Las cronoquinas son proteínas que determinan funciones sistémicas y procesos de envejecimiento biológico, y pueden emplearse para desarrollar una terapia que combata el deterioro cognitivo observado en la EA.

Klotho es una proteína pleiotrópica que desempeña un importante papel antienvejecimiento y neuroprotector en el cerebro. La isoforma secretada (sKL) ha demostrado mejorar la cognición y la memoria en ratones envejecidos. La disminución en la expresión de sKL con la edad o en la patología de la EA la posiciona como una candidata terapéutica prometedora para la EA.

En la presente tesis, se probó la administración sistémica de sKL humano recombinante en un modelo de ratón de EA. Ratones APP/Tau de cinco meses recibieron inyecciones intraperitoneales diarias de sKL recombinante durante 6 semanas. El tratamiento con sKL no afectó el peso ni la actividad locomotora de los ratones con EA. A pesar del fenotipo relativamente leve de EA en los ratones, especialmente entre las hembras, se observó una modesta mejora en la memoria de reconocimiento en los ratones machos con EA tras el tratamiento con sKL. El análisis transcriptómico sugirió que esta mejora cognitiva podría involucrar una mayor neurotransmisión de glutamato, aunque el mecanismo preciso sigue siendo poco claro debido a la incapacidad de sKL para cruzar la barrera hematoencefálica.

A pesar de las propiedades pleiotrópicas de sKL, podría no ser suficiente como un tratamiento independiente para la EA. En consecuencia, una combinación de varias cronoquinas podría representar una estrategia terapéutica más potente. En la presente tesis se diseñó una nueva cronoquina quimérica, HEBE, integrando los efectos neuroprotectores de sKL, las mejoras en la función microglial de sTREM2 y la promoción de la diferenciación neuronal y la densidad sináptica de TIMP2. Las pruebas in vitro de HEBE revelaron nuevas funciones derivadas de la combinación de las proteínas, aunque la subunidad TIMP2 en HEBE no pudo inhibir las MMPs. Posteriormente, HEBE se evaluó in vivo mediante terapia génica usando un vector AAV9P31 en ratones APP/Tau de 24 semanas de edad, y se realizaron pruebas de comportamiento y cognitivas a las 36 semanas de edad. Los ratones con EA mostraron un fenotipo marcado, y HEBE mejoró significativamente la memoria de reconocimiento y el aprendizaje espacial, sin efectos tóxicos. Estas mejoras coincidieron con una reducción de las acumulaciones de pTau en el hipocampo y modestas mejoras transcripcionales en el hipocampo y la corteza entorrinal.

También se generó una segunda versión de HEBE, llamada HEBE2, para superar la falta de inhibición de MMP por parte de TIMP2 en HEBE, y para lograr una expresión más sostenida de la proteína mediante la modificación del promotor. Futuros estudios evaluarán la eficacia de HEBE2 in vitro e in vivo para determinar su potencial para mejorar los resultados funcionales en comparación con HEBE.

Alzheimer's disease (AD) is the most common form of dementia worldwide. This neurodegenerative disorder is characterized by amyloid-β and Tau protein depositions in the brain, alongside dysregulated pathways and cellular processes. Despite numerous proposed therapeutic approaches, no definitive treatment has been approved to cure or prevent AD due to its multifaceted nature, rendering single-target strategies inefficient. Therefore, pleiotropic proteins like chronokines offer a potential alternative for effective AD therapy. Chronokines are proteins that determine systemic functions and biological aging processes, and they can be employed to develop a therapy aiming to combat the cognitive decline observed in AD.

Klotho is a pleiotropic protein that plays an important anti-aging and neuroprotective role in the brain. The secreted isoform (sKL) has demonstrated cognitive enhancement and memory improvement in aged mice. The decline in sKL expression with age or in AD pathology positions it as a promising therapeutic candidate for AD.

In the present thesis, the systemic administration of recombinant human sKL was tested in a mouse model of AD. Five-month-old APP/Tau mice received daily intraperitoneal injections of recombinant sKL over 6 weeks. Notably, sKL treatment did not impact the weight or locomotor activity of AD mice. Despite the relatively mild AD phenotype in the mice, particularly among females, a modest enhancement in recognition memory was observed in male AD mice following sKL treatment. Transcriptomic analysis suggested that this cognitive improvement might involve enhanced glutamate neurotransmission, although the precise mechanism remains unclear due to sKL's inability to cross the blood-brain barrier.

Despite sKL’s pleiotropic properties, it may not be sufficient as a standalone AD treatment. Consequently, a combination of various chronokines could represent a more potent therapeutic strategy. In the present thesis, a novel chimeric chronokine, HEBE, was engineered by integrating sKL's neuroprotective effects, sTREM2's microglial function improvements, and TIMP2's neuronal differentiation and synapse density promotion. In vitro testing of HEBE revealed new functions derived from the assembly of the proteins, while the TIMP2 subunit in HEBE was not able to inhibit MMPs. Subsequently, HEBE was evaluated in vivo via gene therapy using an AAV9P31 vector in 24-week-old APP/Tau mice, and behavioral and cognitive tests were performed at 36 weeks of age. AD mice showed a marked phenotype, and HEBE significantly improved recognition memory and spatial learning, without toxic effects. These improvements coincided with reduced pTau depositions in the hippocampus and modest transcriptional enhancements in the hippocampus and entorhinal cortex.

A second version of HEBE was also generated, called HEBE2, to overcome the lack of MMP inhibition by TIMP2 in HEBE, and to achieve more sustained expression of the protein via promoter modification. Future studies will assess HEBE2's efficacy in vitro and in vivo to ascertain its potential for improved functional outcomes compared to HEBE.