Identification of mitochondrial epigenetic signatures for the prognosis of Alzheimer’s disease

Abstract

El diagnòstic i la predicció de la Malaltia d'Alzheimer (MA) en les primeres etapes es basa principalment en símptomes clínics. Les tècniques d'imatge neurofuncional aprovades per la FDA i els biomarcadors del líquid cefalorraquidi poden ajudar en la detecció i el diagnòstic, però la implementació clínica d'aquestes tècniques està limitada per la disponibilitat, el cost i la invasivitat. Preveure la progressió a la demència de la MA (DMA) en el deteriorament cognitiu lleu (DCL) és crucial. Els criteris d'inclusió actuals per als assajos clínics destinats a fàrmacs per a la MA requereixen pacients DCL amb una puntuació de l'Escala Clínica de Demencia igual a 0,5, i una Tomografía PET beta amiloide (Aβ) positiva. No obstant, la sensibilitat i especificitat de la Tomografia PET Aβ per a la progressió de la fase de DCL a MA mostra variabilitat depenent de l'estudi clínic. A més, la inclusió de falsos positius perjudica la taxa d'èxit dels assajos clínics. Actualment, s'està impulsant l'exploració de nous biomarcadors basats en sang independents d'Aβ i tau. Diversos estudis han reportat disfunció mitocondrial en la MA a nivells cerebrals i sistèmics. Aquesta tesi doctoral presenta el desenvolupament del MAP-AD® Test, basat en l'anàlisi de Seqüenciació de Nova Generació de biomarcadors epigenètics patentats de l'ADN mitocondrial (ADNmt) presents en la sang de pacients DCL. Proporciona un percentatge de progressió a DMA, indicant la possibilitat de desenvolupament de la malaltia. A més, proporciona la validació analítica del producte per obtenir la documentació tècnica necessària per demostrar la conformitat d'un dispositiu de diagnòstic in vitro davant les agències reguladores. L'estudi clínic del MAP-AD® Test es duu a terme utilitzant ADN de sang total de dos grups d'individus: individus cognitivament normals i pacients amb DCL, aquests classificats en dues categories: Progressats i No Progressats a DMA. L'estudi inclou un total de 600 individus reclutats de diferents cohorts. El conjunt de dades original es divideix aleatòriament en dos subconjunts: entrenament i prova. El procés de mostreig aleatori es condueix dins de cada grup. Les característiques analitzades cobreixen dues fonts principals d'informació: variables clíniques recollides (edat, puntuació CDR-SOB i genotip ApoE) i mesures de metilació generades internament utilitzant els Oligos del MAP-AD® Test. El Random Forest és el mètode d'aprenentatge supervisat emprat per construir el model. Els resultats del rendiment clínic en la classificació de pacients amb DCL progressats a DMA demostren una sensibilitat de 0,951 i una especificitat de 0,707; un valor predictiu positiu de 0,773; un valor predictiu negatiu de 0,932; i un F1-score de 0,853. El model exhibeix un equilibri sòlid entre identificar amb precisió els casos positius i la seva precisió predictiva global. La corba AUC-ROC per DCL Progressat vs. Altres en el subconjunt de prova és 0,903 (0,847-0,959). Aquests resultats demostren el paper important de les marques mitoepigenètiques en sang en la predicció de la progressió de DCL a DMA. La validació analítica estudia l'estabilitat de l'ADNmt en diversos escenaris. Els resultats indiquen que les mostres de sang emmagatzemades a temperatura ambient mantenen els nivells de metilació. A més, la metilació de l'ADN es manté estable en l'ADN extret sotmès fins a 12 cicles de congelació-descongelació. L'ADN tractat amb bisulfit es pot emmagatzemar fins a dos mesos a -20 o -80°C sense afectar els resultats de metilació de l'ADNmt. L'estudi també avalua la variabilitat de les mesures de metilcitosina en condicions de repetibilitat i reproductibilitat. Els resultats demostren que l'assaig és repetible i reproduïble, sense variabilitat significativa entre diferents operadors, instal·lacions i lots. La validació analítica confirma el rendiment de l'assaig i dona suport a la finalitat prevista del dispositiu MAP-AD® Test en la mesura precisa de la metilació de l'ADNmt.

El diagnóstico y la predicción de la Enfermedad de Alzheimer (EA) en las primeras etapas se basa en síntomas clínicos. Las técnicas de imagen neurofuncional aprobadas por la FDA y los biomarcadores del líquido cefalorraquídeo ayudan en la detección y el diagnóstico, pero la implementación clínica de estas técnicas está limitada por la disponibilidad, el costo y la invasividad. Prever la progresión a la demencia de la EA (DEA) en el deterioro cognitivo leve (DCL) es crucial. Los criterios de inclusión para los ensayos clínicos de fármacos de la EA requieren pacientes DCL con una puntuación en la Escala Clínica de Demencia igual a 0,5 y una Tomografía PET de beta amiloide (Aβ) positiva. Sin embargo, la sensibilidad y especificidad de la Tomografía PET Aβ para la progresión de la fase de DCL a EA muestra variabilidad entre estudios. Además, la inclusión de falsos positivos perjudica la tasa de éxito de estos. Actualmente, se estan explorando nuevos biomarcadores basados en sangre independientes de Aβ y tau. Varios estudios han reportado disfunción mitocondrial en la EA a niveles cerebrales y sistémicos. Esta tesis doctoral presenta el desarrollo del MAP-AD® Test, basado en el análisis de Secuenciación de Nueva Generación de biomarcadores epigenéticos patentados del ADN mitocondrial (ADNmt) presentes en la sangre de pacientes DCL. Proporciona un porcentaje de progresión a DEA, indicando la posibilidad de desarrollo de la enfermedad. Además, proporciona la validación analítica del producto para obtener la documentación técnica necesaria para demostrar la conformidad de un dispositivo de diagnóstico in vitro ante las agencias reguladoras. El estudio clínico del MAP-AD® Test se llevó a cabo utilizando ADN de sangre total de dos grupos de individuos: individuos cognitivamente normales y pacientes con DCL, estos clasificados en dos categorías: Progresados y No Progresados a DEA. El estudio incluye un total de 600 individuos reclutados de diferentes cohortes. El conjunto de datos original se divide aleatoriamente en dos subconjuntos: entrenamiento y prueba. El proceso de muestreo aleatorio se lleva a cabo dentro de cada grupo. Las características analizadas cubren dos fuentes principales de información: variables clínicas recogidas (edad, puntuación CDR-SOB y genotipo ApoE) y medidas de metilación generadas internamente utilizando los Oligos del MAP-AD® Test. Random Forest es el método de aprendizaje supervisado utilizado para construir el modelo. Los resultados del rendimiento clínico en la clasificación de pacientes con DCL progresados a DEA muestran una sensibilidad de 0,951 y una especificidad de 0,707; un valor predictivo positivo de 0,773; un valor predictivo negativo de 0,932; y un F1-score de 0,853. El modelo exhibe un equilibrio sólido entre identificar con precisión los casos positivos y su precisión predictiva global. La curva AUC-ROC para DCL Progresado vs. Otros en el subconjunto de prueba es 0,903 (0,847-0,959). Estos resultados demuestran el papel importante de las marcas mitoepigenéticas en sangre en la predicción de la progresión de DCL a DME. El estudio de validación analítica estudia la estabilidad del ADNmt en diversos escenarios. Los resultados indican que las muestras de sangre almacenadas a temperatura ambiente mantienen los niveles de metilación. Además, la metilación del ADN se mantiene estable en el ADN extraído sometido hasta 12 ciclos de congelación-descongelación. El ADN tratado con bisulfito se puede almacenar hasta dos meses a -20 o -80°C sin afectar los resultados de metilación del ADNmt. El estudio evalúa la variabilidad de las medidas de metilcitosina en condiciones de repetibilidad y reproducibilidad, mostrando que MAP-AD® Test es consistente, sin variabilidad significativa entre operadores, instalaciones y lotes. La validación analítica confirma el rendimiento de la prueba y apoya la finalidad prevista del dispositivo MAP-AD® Test en la medición precisa de la metilación del ADNmt.

The diagnosis and prediction of early Alzheimer's Disease (AD) is largely guided by clinical symptoms. FDA-approved neuroimaging and Cerebrospinal Fluid biomarkers can aid in detection and diagnosis, but the clinical implementation of these testing modalities is limited by availability, cost, and invasiveness. The prediction of progression to Alzheimer Disease Dementia (ADD) at the Mild Cognitive Impairment (MCI) stage is an unmet medical need. The current inclusion criteria for clinical trials destinated to AD drug development is MCI patients with a Clinical Dementia Rating equal to 0,5, and a positive Aβ.PET scan. However, the sensitivity and specificity of the Aβ-PET scan for the progression of MCI stage to AD show variability depending on the clinical study. In addition, the inclusion of false positives impairs the success rate of clinical trials. Discoveries in the field of AD are evolving, driving the exploration of new blood-based biomarkers independent from and tau. Several studies have reported mitochondrial dysfunction in AD at cerebral and systemic levels. This doctoral thesis presents the development of a cutting-edge diagnostic technology, the MAP-AD® Test, based on Next-Generation Sequencing analysis of patented mitochondrial DNA (mtDNA) epigenetic biomarkers present in the blood of patients with MCI. It provides a percentage of progression to ADD using a machine learning approach, indicating the possibility of disease development. Additionally, it provides the analytical validation of the product to obtain the technical documentation required to demonstrate the conformity of an in vitro diagnostic device to European and American Regulatory Agencies. The MAP-AD® Test clinical study was conducted using DNA from whole blood collected from two groups of subjects: Cognitively normal subjects, and MCI patients, that were classified in two categories: Progressed and Non-Progressed to ADD. A total of 600 subjects recruited from different cohorts were included in the study. The original sample dataset was randomly split into two main subsets: training and testing. The random sampling process was driven within each group to preserve the overall class distribution of the data. The features analysed covered two principal sources of information: collected clinical variables (age, CDR-SOB score, and ApoE genotype), and in-house generated methylation measures using the MAP-AD® Test Oligos. Random Forest was the supervised learning method employed to construct the model. The results of the clinical performance on classifying MCI patients progressed to ADD demonstrated a sensitivity of 0,951 and a specificity of 0,707; a Positive Predicted Value equal to 0,773; a Negative Predicted Value equal to 0,932; and a F1-score equal to 0,853. The model exhibits a solid balance between accurately identifying positive cases and its overall prediction accuracy. The AUC-ROC curve for MCI Progressed vs. Others in the testing subset is 0,903 (95% CI 0,847-0,959). These findings demonstrate the role of blood mitoepigenetic signatures in predicting the progression from MCI to ADD. The analytical validation study aimed to analyse the stability of mtDNA in several scenarios. Key findings from DNA methylation data indicate that blood samples stored at room temperature maintained methylation levels. Further, DNA methylation remained stable in extracted DNA subjected to up to 12 freeze-thaw cycles. Additionally, bisulfite-treated DNA could be stored for up to two months at -20°C or -80°C without affecting mtDNA methylation results. The study also evaluated the variability of methylcytosine measurements under repeatability and reproducibility conditions. Results showed that the assay is repeatable and reproducible, with no significant variability within a run or across different operators, facilities, and instrument sets. Overall, the analytical validation confirmed the performance of the assay, supporting the intended purpose of the device and