Neuroblastoma cell-based tools for the detection of marine VGSC-blocking neurotoxins

Abstract

La presència de toxines marines com les tetrodotoxinas (TTXs), les toxines paralitzants de mariscos (PSTs) i les ciguatoxinas (CTXs) a Europa i el fet que encara no s'ha trobat un antídot, els casos d'enverinament degut al consum de productes marins contaminats amb aquestes toxines continuen sent un problema a tot el món. La necessitat de mètodes de detecció d'alt rendiment per a protegir els consumidors dels riscos d'aquests enverinaments continua sent urgent. Aquesta tesi té com a objectiu contribuir al desenvolupament d'eines basades en cèl·lules per a la detecció de toxines marines, aplanant el camí cap a la implementació de mètodes de detecció i quantificació toxicològica de baix cost, simples i de confiança alternatius al bioassaigs de ratolí per a la seguretat alimentària i fins de monitoratge ambiental. Per a aconseguir aquest objectiu, aquesta tesi proporciona l'optimització d'un assaig basat en cèl·lules colorimètric per a la detecció de blocadors del canal de sodi activats per voltatge (TTX i PSTs). Es demostra l'aplicabilitat de l'assaig per a l'anàlisi de peixos globus i mariscos. A més, s'estableixen factors d'equivalència de toxicitat per als anàlegs de TTX purificats del fetge d'un espècimen de peix globus. Els polímers de ciclodextrina s'exploten com a nous materials sostenibles de neteja i preconcentració. A més, s'explora l'ús d'anticossos monoclonals per a neutralitzar TTX en matrius biològiques naturalment contaminades. Cap al desenvolupament d'un biosensor basat en cèl·lules, les cèl·lules Neuro-2a s'immobilitzen en elèctrodes de diferents materials i la seva presència i activitat de deshidrogenasa s'avaluen utilitzant diferents tècniques. Finalment, es demostra un concepte de prova de l'ús de la tècnica desenvolupada com una poderosa eina de detecció per a monitorar la presència de TTXs i CTXs en mostres de peixos.

La presencia de toxinas marinas como las tetrodotoxinas (TTXs), las toxinas paralizantes de mariscos (PSTs) y las ciguatoxinas (CTXs) en Europa y el hecho de que aún no se ha encontrado un antídoto, los casos de envenenamiento debido al consumo de productos marinos contaminados con estas toxinas siguen siendo un problema en todo el mundo. La necesidad de métodos de detección de alto rendimiento para proteger a los consumidores de los riesgos de estos envenenamientos sigue siendo urgente. Esta tesis tiene como objetivo contribuir al desarrollo de herramientas basadas en células para la detección de toxinas marinas, allanando el camino hacia la implementación de métodos de detección y cuantificación toxicológica de bajo costo, simples y confiables alternativos al bioensayo de ratón para la seguridad alimentaria y fines de monitoreo ambiental. Para lograr este objetivo, esta tesis proporciona la optimización de un ensayo basado en células colorimétrico para la detección de bloqueadores del canal de sodio activados por voltaje (TTX y PSTs). Se demuestra la aplicabilidad del ensayo para el análisis de peces globo y mariscos. Además, se establecen factores de equivalencia de toxicidad para los análogos de TTX purificados del hígado de un espécimen de pez globo. Los polímeros de ciclodextrina se explotan como nuevos materiales sostenibles de limpieza y preconcentración. Además, se explora el uso de anticuerpos monoclonales para neutralizar TTX en matrices biológicas naturalmente contaminadas. Hacia el desarrollo de un biosensor basado en células, las células Neuro-2a se inmovilizan en electrodos de diferentes materiales y su presencia y actividad de deshidrogenasa se evalúan utilizando diferentes técnicas. Finalmente, se demuestra un concepto de prueba del uso de la técnica desarrollada como una poderosa herramienta de detección para monitorear la presencia de TTXs y CTXs en muestras de peces.

The presence of marine toxins like tetrodotoxins (TTXs), paralytic shellfish toxins (PSTs) and ciguatoxins (CTXs) in Europe and the fact that no antidote has yet been found, poisoning cases due to consumption of seafood products contaminated with these toxins are still an issue around the world. The need for high-throughput detection methods to protect consumers from the risks of these poisonings remains urgent. This thesis aims to contribute to the development of cell-based tools for the detection of marine toxins paving the way towards the implementation of low cost, simple, and reliable toxicological screening and quantification methods alternative to the mouse bioassay for food safety and environmental monitoring purposes. In order to achieve this objective, this thesis provides the optimisation of a colorimetric cell based assay for the detection of voltage gated sodium channel blockers (TTX and PSTs). The applicability of the assay to the analysis of pufferfish and shellfish is demonstrated. In addition, toxicity equivalency factors are established for TTX analogues purified from the liver of a puffer fish specimen. Cyclodextrin polymers are exploited as a new sustainable clean-up and pre concentration materials. Furthermore, the use of monoclonal antibody to neutralise TTX in naturally contaminated biological matrices is explored. Towards the development of cell based biosensor, Neuro-2a cells are immobilised on electrodes of different materials and their presence and dehydrogenase activity are assessed using different techniques. Finally, a proof of concept of the use of the developed technique as a powerful screening tool to monitor the presence of TTXs and CTXs in fish samples is demonstrated.