Decoding the regulatory grammar of hematopoiesis using synthetic enhancers

Abstract

During cellular differentiation, gene regulatory elements (GREs) play a crucial role in converting expression gradients of transcription factors (TF) into precise target gene activation. However, the underlying rules are poorly understood. In particular, the complexity of regulatory DNA sequences makes it challenging to understand the underlying cis-regulatory principles of how the DNA sequences generates a specific activity pattern. In this work, we functionally characterized 62,126 synthetic DNA sequences to dissect the design principles of cell-state-specific enhancers within the context of hematopoietic differentiation. We quantify the synthetic enhancers in seven myeloid cell states using an ex vivo differentiation system. In addition, we record their activity in the K562 cancer cell line. We assessed the activity of 38 individual TFs and their pairwise interactions in a cell-state-specific manner. Our analysis demonstrated that identical TF binding sites could act as either repressors or activators depending on cellular context, binding site combinations, and TF occupancy. Moreover, combinations of activating sites frequently neutralized each other or even gained repressive function, a phenomenon observed in primary hematopoiesis but not in leukemia cells. These negative synergies play a crucial role in converting TF expression imbalances into binary gene expression outcomes, offering a new understanding of how lineage-specific gene regulation is encoded in GREs. This knowledge can be harnessed to design synthetic enhancers with tailored activity for specific stages of blood cell differentiation.

Durant la diferenciació cel·lular, els elements reguladors del gens (GREs) tenen un paper crucial en convertir els gradients d'expressió dels factors de transcripció (TF) en l’activació precisa dels gens que regulen. Tanmateix, les regles subjacents són poc conegudes. En particular, la complexitat de les seqüències de l’ADN regulador fa que sigui difícil entendre els principis cis-reguladors que expliquen com les seqüències d'ADN generen un patró d'activitat específic. En aquesta tesi, hem caracteritzat funcionalment 62.126 seqüències d'ADN sintètic per disseccionar els principis que dissenyen els potenciadors específics als estat cel·lulars en el context de la diferenciació hematopoètica. Hem quantificat els potenciadors sintètics en set estats cel·lulars mieloides utilitzant un sistema de diferenciació ex vivo. A més, hem registrat la seva activitat en la línia cel·lular cancerosa K562. Hem avaluat l'activitat de 38 TFs individuals i les seves interaccions per parelles de manera específica per a cada estat cel·lular. Els nostres anàlisis demostren que llocs d'unió de TFs idèntics poden actuar com a repressors o activadors segons el context cel·lular, les combinacions dels llocs d'unió i l'ocupació dels TFs. A més, les combinacions de llocs activadors sovint es neutralitzen entre si o fins i tot adquireixen funció repressora, un fenomen observat en l'hematopoesi primària però no en les cèl·lules leucèmiques. Aquestes sinergies negatives tenen un paper crucial en la conversió dels desequilibris d'expressió dels TFs en resultats binaris d'expressió gènica, oferint una nova comprensió de com la regulació dels gens està codificada en els GREs de manera específica per cada llinatge. Aquest coneixement pot ser utilitzat per dissenyar potenciadors sintètics amb l’activitat adequada per a les etapes específiques de la diferenciació de les cèl·lules sanguínies.