Development of DNA-based assays for the detection of Trichomonas vaginalis

Abstract

El paràsit Trichomonas vaginalis és l'agent causal de la tricomoniasi – la infecció de transmissió sexual (ITS) no vírica i curable més comú del món des de fa molt de temps. Hi ha nombrosos assaigs per a la detecció de T. vaginalis, però el diagnòstic sindròmic preval als països d'ingressos baixos i mitjans degut a la limitació de recursos i d’accés a proves diagnòstiques. Cal substituir el diagnòstic sindròmic per un etiològic, que detecti el paràsit en part o íntegrament. El desenvolupament de proves alternatives, ràpides i de baix cost al punt d'atenció (POCT) per a T. vaginalis s'ha identificat com una de les prioritats mundials de recerca de les ITS, establerta per l'Organització Mundial de la Salut. A més, aquest és un pas clau en l’assoliment de l'objectiu per al 2030 de reduir en un 50% els casos de tricomoniasi i de l'objectiu general d'eliminar les ITS com a amenaça per a la salut pública.

Aquesta tesi doctoral presenta el desenvolupament d'assaigs basats a l'ADN que es poden implementar en un POCT basat a l'ADN per a T. vaginalis. Es van desenvolupar dues proves de flux lateral (LFA) basades a l'ADN a partir de treballs inicials amb assaigs basats en microplaques. Ambdós LFA exploten l'ús d'oligonucleòtids d'ADN com a molècula de bioreconeixement i manquen del típic sistema biotina/estreptavidina. El primer assaig utilitza una parella d'aptàmers d'ADN seleccionats contra la proteïna 65 per a la detecció directa de T. vaginalis. El segon assaig utilitza encebadors de cua per a l'amplificació isotèrmica de l'ADN repetitiu de T. vaginalis i la detecció per hibridació de l'ADN amb oligonucleòtids complementaris. L'avaluació preliminar amb mostres clíniques va demostrar el potencial dels assaigs desenvolupats com a POCT.

El parásito Trichomonas vaginalis es el agente causal de la tricomoniasis – la infección de transmisión sexual (ITS) no vírica y curable más común del mundo desde hace mucho tiempo. Existen numerosos ensayos para la detección de T. vaginalis, pero el diagnóstico sindrómico prevalece en los países de ingresos bajos y medios debido a la limitación de recursos y de acceso a pruebas diagnósticas. Es necesario sustituir el diagnóstico sindrómico por uno etiológico, que detecte el parásito en parte o en su totalidad. El desarrollo de pruebas alternativas, rápidas y de bajo coste en el punto de atención (POCT) para T. vaginalis se ha identificado como una de las prioridades mundiales de investigación de las ITS, establecida por la Organización Mundial de la Salud. Además, este es un paso clave para alcanzar el objetivo de2030 de reducir en un 50% los casos de tricomoniasis y del objetivo general de eliminar las ITS como amenaza para la salud pública.

Esta tesis doctoral presenta el desarrollo de ensayos basados en el ADN que pueden ser implementados en un POCT basado en el ADN para T. vaginalis. Se desarrollaron dos pruebas de flujo lateral (LFA) basadas en el ADN a partir de trabajos iniciales con ensayos basados en microplacas. Ambos LFAs explotan el uso de oligonucleótidos de ADN como molécula de biorreconocimiento y carecen del típico sistema biotina/estreptavidina. El primer ensayo utiliza una pareja de aptámeros de ADN seleccionados contra la proteína adhesina 65 para la detección directa de T. vaginalis. El segundo ensayo utiliza cebadores de cola para la amplificación isotérmica del ADN repetitivo de T. vaginalis y la detección por hibridación del ADN con oligonucleótidos complementarios. La evaluación preliminar con muestras clínicas demostró el potencial de los ensayos desarrollados como POCT.

The parasite Trichomonas vaginalis is the causative agent of trichomoniasis – the longstanding world’s most common, non-viral, curable sexually transmitted infection (STI). Numerous assays are available for the detection of T. vaginalis but syndromic diagnosis prevails in low- and middle-income countries due to limited resources and access. There is a need to replace syndromic diagnosis with an etiological one, detecting the parasite in part or in whole. The development of alternative low-cost, rapid point-of-care tests (POCTs) for T. vaginalis has been identified as one of the global STI research priorities set by the World Health Organization. Moreover, this is a key step in the realization of the 2030 goal of 50% reduction of cases of trichomoniasis and the overall goal of eliminating STIs as a public health threat.

This doctoral thesis presents the development of DNA-based assays that can be implemented in a DNA-based POCT for T. vaginalis. Two DNA-based lateral flow tests (LFAs) were developed from initial works using microplate-based assays. Both LFAs exploit the use of DNA oligonucleotides as biorecognition molecule and are devoid of the typical biotin/streptavidin system. The first assay utilizes a pair of DNA aptamers, selected against the adhesin protein 65, for the direct detection of the T. vaginalis. The second assay utilizes tailed primers for the isothermal amplification of T. vaginalis repeatitive DNA and detection by DNA hybridization to complementary oligonucleotides. Preliminary evaluation against clinical samples demonstrated potential of the developed assays as POCTs.