Harnessing public neoantigens to develop TCR gene-engineered T-cell therapies

Abstract

Els tumors acumulen mutacions que poden generar neoantigens privats, quan s’originen d’alteracions úniques del pacient; o compartits, a l’originar-se de mutacions recurrents en punts calents de gens impulsors del càncer, les quals se succeeixen en múltiples pacients. Quan els pèptids derivats de neoantigens compartits es presenten en al·lels d’HLA prevalents, es consideren neoantigens públics, els quals representen dianes terapèutiques ideals per les immunoteràpies contra el càncer per diverses raons. Primer, són específics del tumor, vitals per al manteniment del fenotip maligne i tenen una alta probabilitat de ser clonals o expressats per la majoria de cèl·lules canceroses. Segon, gràcies a la seva alta recurrència, ofereixen la possibilitat de desenvolupar teràpies basades en cèl·lules T modificades genèticament amb receptors de cèl·lules T (TCR) específics, ampliant l’aplicabilitat de la teràpia adoptiva amb cèl·lules T a múltiples pacients. Malgrat la identificació de centenars de mutacions recurrents, tan sols una petita fracció de neoantigens públics immunogènics i TCR reactius han sigut identificats.

En aquesta tesi, hem seguit una aproximació d’immunopeptidòmica basada en espectrometria de masses (IP-MS) per descobrir pèptids derivats de neoantigens compartits presentats en al·lels d’HLA-I prevalents. Posteriorment, vam detectar i caracteritzar TCRs específics per a aquests pèptids, els quals podrien ser utilitzats per desenvolupar noves teràpies basades en cèl·lules T dirigides contra neoantigens públics.

Primerament, vam dissenyar una plataforma cel·lular basada en cèl·lules HLA-I monoal·lèliques per identificar neoantigens públics derivats de 35 mutacions recurrents en 13 gens impulsors del càncer i 12 al·lels d’HLA-I altament prevalents en la població caucàsica. Amb aquest objectiu, vam generar quatre constructes (HSTMG) codificant per les mutacions recurrents seleccionades i 12 B2M_HLA-I quimeres per als al·lels prioritzats. Seguidament, vam generar una línia cel·lular nul·la pel gen B2M mitjançant CRISPR/Cas9 per a l’obtenció de cèl·lules B2M KO sense expressió d’HLA-I en la superfície cel·lular. Les cèl·lules tumorals B2M KO van ser co-electroporades amb ARN derivat d’una quimera B2M_HLA-I i un dels quatre HSTMGs per a generar cèl·lules HLA-I monoal·lèliques amb expressió de les mutacions recurrents d’interès. Posteriorment, vam realitzar IP-MS en cèl·lules que expressaven un total de 37 combinacions HSTMG-B2M_HLA-I per tal d’identificar pèptids processats i presentats de forma natural en HLA-I. Finalment, els neoantigens detectats van ser validats usant espectrometria de monitoratge de reacció paral·lela (PRM-MS). Mitjançant aquesta plataforma vam validar 49 parelles de pèptid-HLA-I derivats de 23 neoantigens compartits presentats en 10 al·lels d’HLA-I. A més, el nostre mètode basat en cèl·lules HLA-I monoal·lèliques va capturar 19 dels 29 neoantigens públics reportats prèviament i 33 noves parelles de neoepítops-HLA-I. Per determinar si algun dels neoantigens públics candidats podien ser reconeguts per limfòcits T, vam dur a terme experiments de sensibilització in vitro amb limfòcits de sang perifèrica d’una pacient amb càncer de mama. Aquesta estratègia va generar dues reactivitats específiques de cèl·lules T restringides a HLA-A*11:01 per PIK3CAp.E545K i TP53p.R248Q, així com una resposta restringida a HLA-C*04:01 per PIK3CAp.R88Q. En seqüenciar els TCRS d’aquestes cèl·lules T reactives, vam identificar tres TCRs reactius, cadascun d’ells específic per un dels tres neoantigens públics mencionats. Notablement, els tres TCRs reactius van demostrar un reconeixement preferencial de les seves dianes en el context de processament i presentació per cèl·lules tumorals in vitro, indicant un gran potencial per al desenvolupament de teràpies basades en cèl·lules T.

En resum, el nostre mètode basat en IP-MS de cèl·lules HLA-I monoal·lèliques, va permetre identificar una gran varietat de neoantigens públics candidats. Aquestes identificacions amplien el número de dianes terapèutiques disponibles per a la immunoteràpia del càncer. A més, la identificació dels TCRs específics per a neoantigens públics obre la possibilitat de generar noves teràpies basades en cèl·lules T aplicables a múltiples pacients amb càncer.

Los tumores acumulan mutaciones que pueden generar neoantigenos privados, cuando se originan de alteraciones únicas del paciente; o compartidos, al originarse de mutaciones recurrentes en puntos calientes de genes impulsores del cáncer, las cuales se suceden en múltiples pacientes. Cuando los péptidos derivados de neoantigenos compartidos se presentan en alelos de HLA prevalentes, se consideran neoantigenos públicos, los cuales representan dianas terapéuticas ideales para las inmunoterapias contra el cáncer por varias razones. Primero son específicos del tumor, vitales para mantener el fenotipo maligno y tienen una alta probabilidad de ser clonales o expresados por la mayoría de las células cancerosas. Segundo, debido a su alta recurrencia, ofrecen la posibilidad de desarrollar terapias basadas en células T modificadas genéticamente con receptores de células T (TCR) específicos, ampliando la aplicabilidad de la terapia adoptiva con células T a múltiples pacientes. Sin embargo, a pesar de la identificación de cientos de mutaciones recurrentes, solo una pequeña fracción de neoantigenos públicos inmunogénicos y TCRs reactivos han sido identificados.

En esta tesis, seguimos una aproximación de inmunopeptidomica basada en espectrometría de masas (IP-MS) para descubrir péptidos derivados de neoantigenos compartidos presentados en alelos HLA-I prevalentes. Posteriormente, detectamos y caracterizamos TCRs específicos para estos péptidos, los cuales podrían ser utilizados para desarrollar nuevas terapias basadas en células T dirigidas contra neoantigenos públicos.

Primeramente, desarrollamos una plataforma celular basada en células HLA-I monoalelicas para identificar neoantigenos públicos derivados de 35 mutaciones recurrentes en 13 genes impulsores del cáncer y 12 alelos HLA-I altamente prevalentes en la población caucásica. Para ello, diseñamos cuatro constructos (HSTMG) codificantes para las mutaciones recurrentes seleccionadas y 12 B2M_HLA-I quimeras para los alelos priorizados. Seguidamente, generamos una línea celular nula para el gen B2M mediante CRISPR/Cas9, obteniendo células B2M KO sin expresión de HLA-I en la superficie celular. Las células tumorales B2M KO fueron co-electroporadas con ARN derivado de una quimera B2M_HLA-I y uno de los cuatro HSTMGs para generar células HLA-I monoalelicas con expresión de las mutaciones recurrentes de interés. Posteriormente, realizamos IP-MS en células que expresaban un total de 37 combinaciones HSTMG-B2M_HLA-I para identificar péptidos procesados y presentados de forma natural en HLA-I. Finalmente, los neoantigenos detectados fueron validados mediante espectrometría de monitoreo de reacción paralela (PRM-MS). A través de esta plataforma validamos 49 parejas de péptido-HLA-I derivadas de 23 neoantigenos compartidos presentados en 10 alelos HLA-I. Además, nuestro método basado en células HLA-I monoalelicas capturó 19 de los 29 neoantigenos públicos reportados previamente y 33 nuevas parejas de neoepítopos-HLA-I. Para determinar si algunos de los neoantigenos públicos candidatos eran reconocidos por linfocitos T, realizamos experimentos de sensibilización in vitro con linfocitos de sangre periférica de una paciente con cáncer de mama. Esta estrategia generó dos reactividades específicas de células T restringidas por HLA-A*11:01 para PIK3CAp.E545K y TP53p.R248Q, así como una respuesta restringida por HLA-C*04:01 para PIK3CAp.R88Q. Al secuenciar los TCRs de estas células T reactivas, identificamos tres TCRs reactivos, cada uno de ellos específico para uno de los tres neoantigenos públicos mencionados. Remarcablemente, los tres TCRs reactivos demostraron un reconocimiento preferencial de sus dianas en el contexto de procesamiento y presentación por células tumorales in vitro, indicando un gran potencial para el desarrollo de terapias basadas en células T.

En resumen, a través de nuestro método basado en IP-MS de células HLA-I monoalelicas, identificamos una amplia variedad de neoantigenos públicos candidatos. Estos hallazgos amplían el número de dianas terapéuticas disponibles para la inmunoterapia del cáncer. Además, los TCRs descubiertos específicos para neoantigenos públicos abren la posibilidad de generar nuevas terapias basadas en células T aplicables a múltiples pacientes con cáncer.

Tumors accumulate genetic alterations, some of which may generate “non-self” epitopes recognized by T cells, known as neoantigens. These antigens can arise from private mutations unique to each individual or from shared mutations in hotspot regions of driver genes that occur in multiple cancer patients. When prevalent HLA alleles present epitopes from shared neoantigens, they become public neoantigens. These are ideal targets for cancer immunotherapies for multiple reasons. First, they are exquisitely tumor-specific, vital for sustaining the malignant phenotype, and have a higher likelihood of being clonal or expressed by most cancer cells. Second, due to their high conservation, they offer the possibility of developing off-the-shelf TCR T-cell-based therapies, broadening the applicability of adoptive T-cell therapy to multiple patients. However, despite the identification of hundreds of cancer driver mutations, only a small fraction of immunogenic public neoantigens and reactive TCRs have been identified.

In this thesis, we used a mass spectrometry-based (MS-based) HLA-I immunopeptidomics approach to discover hotspot-derived mutant peptides presented on highly prevalent HLA-I alleles. In addition, we aimed to detect and characterize T-cell receptors (TCRs) targeting these peptides, which could be used to develop novel off-the-shelf TCR-based T-cell therapies targeting public neoantigens.

We developed an HLA-I monoallelic cell platform to identify public neoantigens arising from 35 recurrent mutations across 13 cancer driver genes and 12 highly prevalent HLA-I alleles in the Caucasian population. We first constructed four hotspot tandem minigene (HSTMG) constructs encoding these mutations and B2M_HLA chimeras encompassing the prioritized alleles. Next, we generated a B2M null tumor cell line using CRISPR/Cas9, lacking cell surface HLA-I expression. B2M KO tumor cells were then co-electroporated with in vitro transcribed RNA encoding one B2M_HLA chimera and one of the four HSTMGs to generate HLA-I monoallelic cells expressing recurrent mutations. Last, shotgun MS-based immunopeptidomics was performed on cells expressing a total of 37 HSTMG-B2M_HLA combinations to identify naturally processed and presented HLA-I peptides, which were then validated using parallel reaction monitoring mass spectrometry. Using this strategy, we detected 49 mutant peptide-HLA pairs derived from 23 shared cancer neoantigens presented across 10 HLA-I alleles. Moreover, our method, based on transient HLA-I monoallelic cells, captured 19 previously reported epitopes and, more importantly, 33 novel candidate public neoantigen-HLA pairs. To determine whether some of the putative public neoantigens could be recognized by T cells, we carried out in vitro sensitization experiments using peripheral blood lymphocytes from a breast cancer patient. This strategy raised two HLA-A*11:01-restricted T-cell reactivities specific for PIK3CAp.E545K and TP53p.R248Q, as well as an HLA-C*04:01-restricted response targeting PIK3CAp.R88Q. By sequencing the TCRs of these reactive T cells, we identified three neoantigen-specific TCRs, each displaying specific recognition of the neoantigen compared to the wild-type counterpart. Interestingly, the three reactive TCRs recognized their target when processed and presented by tumor cells in vitro, underscoring their potential to develop off-the-shelf T-cell therapies.

In summary, we identified a diverse array of candidate public neoantigens through comprehensive MS-based immunopeptidomics screening of HLA-I monoallelic cells. These findings expand the number of shared actionable targets for cancer immunotherapy. Furthermore, the discovered TCRs reactive to public neoantigens pave the way for T-cell-based therapies applicable to multiple cancer patients.