Developing a Pipeline for the Discovery of b-HLH-LZ-Based Therapeutics: Insights from Omomyc Engineering

Abstract

MYC és un factor de transcripció essencial en la biologia humana, regulant processos com la proliferació cel·lular, la diferenciació i el metabolisme. La seva desregulació en la majoria de càncers humans, degut a la sobreexpressió i la pèrdua dels controls reguladors, contribueix al creixement i manteniment dels tumors. Per això, la inhibició de MYC és una diana terapèutica atractiva en oncologia. No obstant, la seva naturalesa desordenada i localització nuclear han dificultat la seva inhibició directa. Al 2021, Peptomyc va portar a la clínica el primer inhibidor directe de MYC en forma de mini-proteïna, Omomyc, que actua com a dominant negatiu, amb propietats de penetració cel·lular intrínseca. Aquest avenç ha obert el camí per al desenvolupament d'una nova classe de proteïnes terapèutiques en forma de dominis b-HLH-LZ, inspirant el disseny de molècules similars. Aquesta tesi té com a objectiu establir les bases per al desenvolupament de nous candidats a fàrmacs basats en Omomyc, a través de l'ús d'eines de caracterització rellevants. Es van explorar dues estratègies per potenciar l'activitat antitumoral d'Omomyc: Primer, es va estudiar la modulació de l'eficiència de penetració cel·lular i la localització nuclear de variants derivades d'Omomyc a través de mutacions curtes i la fusió amb pèptids de penetració cel·lular. Amb un panell de 23 variants d'Omomyc o Max*, es va observar que la fusió de CPPs a les variants millorava la seva cinètica de penetració, i l'eficiència general es potenciava amb la fusió d'una seqüència dirigida al EGFR. No obstant això, aquesta millora va comportar una reducció de l'estabilitat estructural, una vinculació a l'ADN menys específica i una solubilitat reduïda. Les truncacions al domini de la cremallera de leucina també van afectar l'estabilitat de la proteïna, amb truncacions majors que disminuïen l'expressió recombinant i la solubilitat. Finalment, es va concloure que l'ús de HisTag agilitava la purificació de variants, però afectava negativament la capacitat de vinculació a l'ADN, limitant la seva avaluació. La segona part de la tesi va explorar com les modificacions en la càrrega neta de les proteïnes derivades d'Omomyc influïen en la solubilitat, la vinculació a MYC, MAX i l'ADN, i la seva activitat cel·lular. Es va demostrar que les variants amb un pI més baix tenien perfils de solubilitat més avantatjosos a pH neutre i bàsic. Tot i que la seva estabilitat estructural era inferior, aquestes variants mantenien la capacitat de vincular-se a MYC i MAX, indicant que les seves funcions nuclears es preservaven malgrat els canvis estructurals. No obstant això, les variants amb canvis profunds en el pI mostraven una afinitat reduïda per l'ADN, que es recuperava mitjançant l'heterodimerització amb Max*. Sorprenentment, la seva capacitat de penetració cel·lular no correlacionava amb l'eficàcia per inhibir la proliferació cel·lular, suggerint que altres factors, com l'estabilitat intracel·lular o la localització nuclear, podrien influir en l'eficàcia terapèutica. A més, un nou assaig va destacar el comportament diferent de les variants en plasma i sang sencera, indicant que la modulació de la càrrega neta podia influir en el perfil farmacocinètic. En conjunt, els resultats d'aquesta tesi proporcionen informació clau sobre els reptes i oportunitats en el desenvolupament de mini-proteïnes derivades d'Omomyc com a agents terapèutics. Tot i que la fusió de CPPs millora la penetració cel·lular, cal equilibrar els compromisos en estabilitat estructural i funcionalitat. Les mutacions de càrrega mostren potencial per millorar la solubilitat i l'estabilitat, fet que podria millorar la farmacocinètica in vivo. Aquest treball avança la comprensió sobre com es pot aconseguir la inhibició de MYC a través del disseny racional de mini-proteïnes, i estableix les bases per a l'optimització futura de les proteïnes b-HLH-LZ com a teràpies viables contra el càncer.

MYC es un factor de transcripción esencial en la biología humana, regulando procesos como la proliferación celular, la diferenciación y el metabolismo. Su desregulación en la mayoría de cánceres humanos, debido a la sobreexpresión y pérdida de los controles reguladores, contribuye al crecimiento y mantenimiento de los tumores. Por eso, la inhibición de MYC es una diana terapéutica atractiva en oncología. Sin embargo, su naturaleza desordenada y localización nuclear han dificultado su inhibición directa. En 2021, Peptomyc llevó a la clínica al primer inhibidor directo de MYC en forma de mini-proteína, Omomyc, que actúa como dominante negativo, con propiedades de penetración celular intrínseca. Este avance ha abierto el camino para el desarrollo de una nueva clase de proteínas terapéuticas en forma de dominios b-HLH-LZ, inspirando el diseño de moléculas similares. Esta tesis tiene como objetivo sentar las bases para el desarrollo de nuevos candidatos a fármacos basados en Omomyc, a través del uso de herramientas de caracterización relevantes. Se exploraron dos estrategias para potenciar la actividad antitumoral de Omomyc: Primero, se estudió la modulación de la eficiencia de penetración celular y la localización nuclear de variantes derivadas de Omomyc a través de mutaciones cortas y la fusión con péptidos de penetración celular. Con un panel de 23 variantes de Omomyc o Max*, se observó que la fusión de CPPs en las variantes mejoraba su cinética de penetración, y la eficiencia general se potenciaba con la fusión de una secuencia dirigida al EGFR. Sin embargo, esta mejora supuso una reducción de la estabilidad estructural, una vinculación al ADN menos específica y una solubilidad reducida. Las truncaciones en el dominio de la cremallera de leucina también afectaron a la estabilidad de la proteína, con truncaciones mayores que disminuían la expresión recombinante y la solubilidad. Por último, se concluyó que el uso de HisTag agilizaba la purificación de variantes, pero afectaba negativamente a la capacidad de vinculación al ADN, limitando su evaluación. La segunda parte de la tesis exploró cómo las modificaciones en la carga neta de las proteínas derivadas de Omomyc influían en la solubilidad, la vinculación a MYC, MAX y el ADN, y su actividad celular. Se demostró que las variantes con un pI más bajo tenían perfiles de solubilidad más ventajosos a pH neutro y básico. Aunque su estabilidad estructural era inferior, estas variantes mantenían la capacidad de vincularse a MYC y MAX, indicando que sus funciones nucleares se preservaban a pesar de los cambios estructurales. Sin embargo, las variantes con cambios profundos en el pI mostraban una afinidad reducida por el ADN, que se recuperaba mediante la heterodimerización con Max*. Sorprendentemente, su capacidad de penetración celular no correlacionaba con la eficacia para inhibir la proliferación celular, sugiriendo que otros factores como la estabilidad intracelular o la localización nuclear podrían influir en la eficacia terapéutica. Además, un nuevo ensayo destacó el comportamiento distinto a las variantes en plasma y sangre entera, indicando que la modulación de la carga limpia podía influir en el perfil farmacocinético. En conjunto, los resultados de esta tesis proporcionan información clave sobre los retos y oportunidades en el desarrollo de mini-proteínas derivadas de Omomyc como agentes terapéuticos. Aunque la fusión de CPPs mejora la penetración celular, es necesario equilibrar los compromisos en estabilidad estructural y funcionalidad. Las mutaciones de carga muestran potencial para mejorar la solubilidad y la estabilidad, lo que podría mejorar la farmacocinética in vivo. Este trabajo avanza la comprensión sobre cómo conseguir la inhibición de MYC a través del diseño racional de mini-proteínas, y sienta las bases para la optimización futura de las proteínas b-HLH-LZ como terapias viables contra el cáncer.

MYC is a transcription factor playing a central role in human biology through its regulation of processes such as cellular proliferation and differentiation or metabolism. MYC was shown to be deregulated in the majority of human cancers through overexpression and loss of normal regulatory controls and to strongly contribute to tumor growth and maintenance. For this reason, MYC inhibition represents a particularly appealing therapeutic target in oncology. However, MYC’s intrinsic disordered nature and nuclear localization made its direct inhibition challenging. In 2021, Peptomyc brought to the clinic the first direct mini-protein MYC inhibitor, named Omomyc, which acts as a MYC dominant negative, with intrinsic cell penetration properties. This major milestone in oncology has paved the way to the development of a new class of therapeutic proteins, in the shape of b-HLH-LZ domains, and was an inspiration for the design of similar molecules. The work presented in this thesis aimed at establishing the foundations for the efficient development of new Omomyc-based drug candidates, through the development of relevant tools and characterization methods. We did so while exploring two strategies to enhance the anti-tumoral Omomyc activity: First, we investigated the modulation of the cell penetration efficiency and nuclear localization of Omomyc-derived variants through the introduction of short-stretch mutations and fusion to cell-penetrating peptides (CPPs). Through the study of a panel of 23 Omomyc- or Max*-derived variants, we determined that the fusion of CPPs to Omomyc variants could improve their cell penetration kinetics and that their overall cell penetration efficiency could be improved through their fusion to an Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-targeting sequence. However, this improvement came at the cost of reduced structural stability, less specific DNA-binding ability and decreased solubility. Furthermore, truncations to the leucine zipper domain affected the protein’s stability, with larger truncations leading to poor recombinant expression and reduced solubility. Finally, we determined that the use of HisTag could be valuable to streamline the purification of large variants panel, but impacted their DNA-binding ability, critically limiting these variants evaluation. The second part of this thesis explored how changes in the net charge of Omomyc-derived proteins influence their solubility, their binding to MYC, MAX and DNA, as well as their cellular activity. First, we could demonstrate that variants with a lower isoelectric point (pI) could exhibit more advantageous solubility profiles both at neutral and basic pH conditions. Despite having an overall reduced structural stability, these charge-modified variants retained the ability to bind to both MYC and MAX, suggesting that their core binding functions were mainly preserved despite structural changes. However, the variants with the most profound pI change presented significantly reduced affinity for DNA, which was seemingly rescued through heterodimerization with Max*. Interestingly, these variants capacity for cell penetration did not correlate with their effectiveness in inhibiting cell proliferation, suggesting that additional factors, such as intracellular stability, nuclear localization, or subtle changes in MAX and/or MYC affinity could play pivotal roles in determining their therapeutic efficacy. Furthermore, a newly developed assay highlighted the charge variants different behavior in plasma and whole blood and suggested that Omomyc variants net charge modulation could impact their pharmacokinetic profile. Overall, the results of this thesis provide important insights into the challenges and opportunities of developing Omomyc-derived mini-proteins as therapeutic agents. While the fusion of CPPs enhances cell penetration, trade-offs in structural stability and functional activity must be carefully balanced. Charge mutations show promise for improving solubility and stability, which could enhance in vivo pharmacokinetics. This work advances the understanding of how MYC inhibition can be achieved through rational design of mini-proteins and lays the groundwork for further optimization of b-HLH-LZ proteins as viable cancer therapeutics.