Study of epidermal growth factor receptor (EGFR) and embryo development of prepubertal goat oocytes in vitro matured with meiotic inhibitors and oocyte-secreted factors

Abstract

La maduració in vitro dels oòcits (IVM) és un factor limitant per a la producció d'embrions in vitro (IVEP), ja que afecta negativament la capacitat dels oòcits per desenvolupar embrions. L'objectiu d’aquest estudi era analitzar el receptor del factor de creixement epidèrmic (EGFR) com a marcador de competència en oòcits de cabres prepuberals, i promoure l'expressió d'aquesta proteïna durant la IVM per millorar la competència dels oòcits per al desenvolupament embrionari. Es van utilitzar dues estratègies d'IVM: (1) atenuar la represa meiòtica espontània amb inhibidors meiòtics en un sistema d'IVM bifàsic (CAPA-IVM) i (2) promoure l'adquisició de competència mitjançant l'addició dels factors secretats per l'oòcit BMP15 i GDF9. En el primer estudi, vam quantificar l'expressió d'EGFR en oòcits de cabres i ovelles prepuberals obtinguts de fol·licles petits (<3 mm, SF) i grans (≥3 mm, LF). Es va quantificar l'EGFR en les cèl·lules del cúmul (CC) mitjançant western blotting i en els oòcits per immunofluorescència. En ambdues espècies, l'expressió d'EGFR en CC i oòcits va ser més elevada en LF que en SF. Això suggereix que l'expressió d'EGFR augmenta amb la mida del fol·licle i està relacionada amb la competència de desenvolupament dels oòcits. En el segon estudi, vam avaluar l'efecte del CAPA-IVM sobre la competència dels oòcits de cabra prepuberals obtinguts de SF i LF. En el primer experiment, els oòcits es van cultivar durant 6 hores en pre-IVM amb 200 nM de pèptid natriurètic tipus C (CNP) i 10 nM d'estradiol com a inhibidors meiòtics. Els resultats van mostrar que la taxa de vesícula germinal (GV) era més alta en els grups CNP que en el grup control (69% vs 28% en SF i 67% vs 31% en LF). En el segon experiment, els oòcits es van cultivar amb IVM convencional (c-IVM) o CAPA-IVM (pre-IVM + c-IVM) i es van avaluar l'expressió de la proteïna EGFR, les espècies reactives d'oxigen intra-oocitàries (ROS) i el desenvolupament de blastocists. En LF, l'expressió d'EGFR i els nivells de ROS intra-oocitaris van ser millors després de CAPA-IVM, però aquestes diferències no es van observar en SF. La taxa de blastocists va ser similar en SF (3,7% vs 2,6%) i LF (8,3% vs 2,5%). En resum, CAPA-IVM va millorar l'expressió d'EGFR i la capacitat antioxidant en oòcits de LF, però els oòcits de SF eren massa immadurs per beneficiar-se’n. En el tercer estudi, es va avaluar l'efecte d'afegir BMP15 i GDF9 al medi d'IVM dels oòcits de cabres prepuberals. Els complexos cúmul-oòcit (COCs) es van madurar in vitro en absència (grup control) o en presència de 100 ng/mL de BMP15, GDF9 o ambdós. Per avaluar la comunicació cúmul-oòcit, es va determinar la densitat de les projeccions transzonals (TZP) a 0 h, 6 h, 12 h i 24 h d’IVM. Després de la IVM, es van mesurar l'expressió d'EGFR, l'expansió del cúmul i l'activitat mitocondrial. Finalment, es va avaluar la producció de blastocists després de l'activació partenogenètica (PA) i la fecundació in vitro (FIV). L’addició de BMP15 va augmentar la densitat de TZP durant les primeres 6 hores i va millorar l'expressió d'EGFR, l'expansió del cúmul, l'activitat mitocondrial i la producció de blastocists després de PA (15,5% vs 6,3%) en comparació amb el control. No es van observar diferències en la producció de blastocists després de FIV. La suplementació amb GDF9, amb o sense BMP15, no va millorar cap paràmetre. En conclusió, l'addició de BMP15 al medi d'IVM, però no de GDF9 ni la CAPA-IVM, millora la maduració citoplasmàtica i la producció de blastocists en ovocits de cabres prepuberals.

La maduración in vitro de los ovocitos (IVM) es un paso limitante para la producción de embriones in vitro (IVEP), ya que afecta negativamente la competencia de los ovocitos para el desarrollo embrionario. El objetivo de este estudio fue analizar el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) como marcador de competencia en ovocitos de cabras prepúberes y promover la expresión de esta proteína durante la IVM para mejorar la competencia de los ovocitos en el desarrollo embrionario. Se emplearon dos estrategias de IVM: (1) atenuar la reanudación meiótica espontánea con inhibidores meióticos en un sistema bifásico (CAPA-IVM) y (2) promover la adquisición de competencia mediante la adición de los factores BMP15 y GDF9, secretados por el ovocito. En el primer estudio, cuantificamos la expresión de EGFR en ovocitos de cabras y ovejas prepúberes obtenidos de folículos pequeños (<3 mm, SF) y grandes (≥3 mm, LF). La expresión de EGFR en las células del cúmulo (CC) se midió mediante western blotting y en ovocitos mediante inmunofluorescencia. En ambas especies, la expresión de EGFR fue mayor en LF que en SF, tanto en ovocitos como en CC. Esto sugiere que la expresión de EGFR aumenta con el tamaño del folículo y se relaciona con la competencia de desarrollo de los ovocitos. En el segundo estudio, evaluamos el efecto de CAPA-IVM sobre la competencia de los ovocitos de cabras prepúberes obtenidos de SF y LF. En el primer experimento, los ovocitos se cultivaron durante 6 horas en pre-IVM con 200 nM de péptido natriurético tipo C (CNP) y 10 nM de estradiol como inhibidores meióticos. La tasa de vesícula germinal (GV) fue mayor en los grupos CNP que en el control (69% vs 28% en SF y 67% vs 31% en LF). En el segundo experimento, los ovocitos se cultivaron con IVM convencional (c-IVM) o CAPA-IVM (pre-IVM + c-IVM) y se evaluaron la expresión de EGFR, los niveles de especies reactivas de oxígeno intraovocitarias (ROS) y el desarrollo de blastocistos. En LF, la expresión de EGFR y los niveles de ROS fueron mejores tras CAPA-IVM, pero estas diferencias no se observaron en SF. La tasa de blastocistos fue similar en SF (3,7% vs 2,6%) y LF (8,3% vs 2,5%). En resumen, CAPA-IVM mejoró la expresión de EGFR y la capacidad antioxidante en ovocitos de LF, pero los ovocitos de SF eran demasiado inmaduros para beneficiarse. En el tercer estudio, se evaluó el efecto de añadir BMP15 y GDF9 al medio de IVM de ovocitos de cabras prepúberes. Los complejos cúmulo-ovocito (COCs) se cultivaron in vitro en ausencia (grupo control) o presencia de 100 ng/mL de BMP15, GDF9 o ambos. Para evaluar la comunicación entre cúmulo y ovocito, se determinó la densidad de las proyecciones transzonales (TZP) a las 0 h, 6 h, 12 h y 24 h de IVM. Tras la IVM, se midió la expresión de EGFR, la expansión del cúmulo y la actividad mitocondrial. Finalmente, se evaluó la producción de blastocistos tras la activación partenogenética (PA) y la fecundación in vitro (FIV). La adición de BMP15 incrementó la densidad de TZP durante las primeras 6 horas y mejoró la expresión de EGFR, la expansión del cúmulo, la actividad mitocondrial y la producción de blastocistos tras PA (15,5% vs 6,3%). No se observaron diferencias en la producción de blastocistos tras FIV. La suplementación con GDF9, sola o combinada con BMP15, no mejoró ningún parámetro. En conclusión, la adición de BMP15 al medio de IVM mejora la maduración citoplasmática y la producción de blastocistos en ovocitos de cabras prepúberes, pero CAPA-IVM no mejoró la producción de embriones.

Oocyte in vitro maturation (IVM) is a limiting step for in vitro embryo production (IVEP) which negatively affects oocyte competence for embryo development. Our objective was to analyze the epidermal growth factor receptor (EGFR) as marker of competence in prepubertal goat oocytes, and to promote the expression of this protein during IVM to increase embryo developmental competence. Two IVM strategies have been used: (1) attenuating spontaneous meiotic resumption using meiotic inhibitors in a biphasic IVM system (CAPA-IVM) and (2) promoting competence acquisition in vitro by adding exogenous oocyte-secreted factors BMP15 and GDF9. In the first study, we quantified the EGFR expression in prepubertal goat and sheep oocytes obtained from small (<3 mm, SF) and large (≥3 mm, LF) follicles. EGFR was quantified in cumulus cells (CC) by western blotting and in oocytes by immunofluorescence. In both species, EGFR expression in CC and oocytes was higher in LF than SF. We conclude that EGFR expression in prepubertal goat cumulus-oocyte complexes (COCs), both in oocytes and CC, increases with follicle size, suggesting it is related with oocyte developmental competence. In the second study, we assessed the effect of CAPA-IVM on oocyte competence of prepubertal goat oocytes from SF and LF. In experiment 1, oocytes were cultured for 6h in pre-IVM with 200 nM C-type natriuretic peptide (CNP) and 10 nM estradiol as meiotic inhibitors, and germinal vesicle (GV) rate was higher in CNP groups than control (69% vs 28%, and 67% vs 31%, SF and LF, respectively). In experiment 2, oocytes were cultured in conventional IVM (c-IVM) or CAPA-IVM (pre-IVM + c-IVM) and EGFR protein expression, intra-oocyte reactive oxygen species (ROS) and blastocyst development were assessed. In LF, EGFR expression after CAPA-IVM was higher compared to c-IVM in oocytes and CC, and intra-oocyte ROS levels were lower in CAPA-IVM. In SF these differences were not observed. c-IVM and CAPA-IVM produced similar blastocyst rates in SF (3.7% vs 2.6%, respectively) and LF (8.3% vs 2.5%, respectively). Overall, CAPA-IVM enhanced EGFR expression for EGF peptide signaling and antioxidant capacity in oocytes from LF but oocytes from SF were too immature to benefit from it. In the third study, we assessed the effect of adding BMP15 and GDF9 to IVM medium of prepubertal goat oocytes. COCs were in vitro matured in absence (control group) or presence of 100 ng/mL of BMP15, GDF9, or both. To determine cumulus-oocyte communication, transzonal projections (TZP) density at 0 h, 6 h, 12 h and 24 h of IVM were evaluated. After IVM, EGFR expression in oocytes and CC, cumulus expansion and mitochondrial activity were measured. Finally, blastocyst rates after parthenogenetic activation (PA) and IVF were assessed. IVM supplementation with BMP15 increased the TZPs density during the first 6 hours of culture. After IVM, BMP15 increased EGFR expression in oocytes and CC, cumulus expansion, oocyte mitochondrial activity and blastocyst production following PA (15.5% vs 6.3%) compared to control. No differences were observed on blastocyst production following IVF. IVM supplementation with GDF9, with or without BMP15, did not improve any parameters. In conclusion, IVM medium supplementation with BMP15, but not GDF9, improves cytoplasmic maturation and PA-blastocyst production of prepubertal goat oocytes. To summarize, we concluded that EGFR expression in prepubertal goat COCs, both in oocytes and CC, increases with follicle size and therefore with oocyte developmental competence. We proved that IVM strategies such as biphasic IVM (CAPA-IVM) and addition of BMP15 to IVM media promote EGFR expression in oocytes and CC from prepubertal goats. Finally, we improved developmental competence of prepubertal goats by adding BMP15 to IVM medium, however CAPA-IVM was not able to improve embryo production regardless of follicle size.