Bulk and Single-Cell Omics for Characterizing Sperm Cryo-tolerance, the Functional Genome of Spermatogenic Cells, and Spermatid Survival in Swine

Abstract

La producció porcina s'enfronta a desafiaments importants de tipus reproductiu, que son crucials per a l'eficiència dels programes d'inseminació artificial. La qualitat del semen varia àmpliament entre verros, la qual cosa fa essencial millorar la comprensió sobre la base molecular de la funció espermàtica. Cal doncs, identificar marcadors moleculars per a diferents caracters espermàtics. Els estudis presentats en aquesta tesi pretenen exploren els mecanismes moleculars subjacents a la criotolerància espermàtica, un paràmetre important per al sector porcí, l'arquitectura funcional del genoma espermàtic i la supervivència de les espermàtides, en porcí. En l'article I, vam avaluar l'efecte sobre el transcriptoma espermàtic del porc de la purificació d'ejaculats amb BoviPure™. Anàlisi de tipus RNA-Seq i d'expressió diferencial entre ejaculats purificats i no purificats, va mostrar una alta similitud entre grups. No obstant, 372 gens van mostrar una abundància diferencial de RNA. La llista de gens diferencialment abundants estava sobre-representada per gens específics de l'epidídim, la qual cosa suggereix que la purificació va eliminar cèl·lules epitelials epididimàries, vesícules extracel·lulars epididimàries o cèl·lules espermàtiques que havien incorporat RNA epididimaris. En l'article II, es va realitzar un GWAS i una anàlisi d'RNA-Seq (RNA total i RNA petit) en 99 i 20 ejaculats de semen, respectivament, cadascun procedent d'un verro Pietrain diferent. L’objectiu era identificar factors genètics i transcriptòmics que influencien la criotolerància espermàtica en porcs. Vam identificar una associació GWAS al cromosoma 12. L’estudi dels RNAs va permetre identificar 13 gens llurs nivells de RNA variaven segons la criotolerància espermàtica. Aquests gens estaven principalment relacionats amb l'estrès oxidatiu i la funció mitocondrial. En l'article III, vàrem caracteritzar l'estructura de la cromatina dels espermatozoides porcins mitjançant el mapatge de les fraccions de cromatina mono- i sub-nucleosòmica de dues mostres. Per a tal fi, es va emprar la nucleasa micrococcal i el seqüenciament d'alt rendiment (Mnase-Seq). L'anàlisi va permetre identificar 25.293 pics mono-nucleosòmics i 4.239 sub-nucleosòmics, i s’observà una conservació posicional entre porcs i humans en regions genòmiques relacionades amb el desenvolupament. Les anàlisis d’ontologia gènica i dels motius de factors de transcripció van revelar associacions amb la funció espermàtica i l'embriogènesi, destacant el motiu ZNF263, un factor de transcripció relacionat amb la regulació de l'expressió preferencial paterna en embrions. En l'article IV, un objectiu va ser obtenir els mapes genòmics funcionals (expressió gènica i accessibilitat de la cromatina), indicatius d'elements reguladors actius (promotors, enhancers), per als diferents tipus cèl·lulars del testicle porcí. L’altre objectiu fou identificar variants genètiques amb efecte potencial sobre la supervivència de les espermàtides. Vam utilitzar la tecnologia single cell multiome ATAC + Gene Expression per a seqüenciar el transcriptoma i la cromatina accessible de 18.550 cèl·lules de quatre verros adults de raça Large White. L'anàlisi identificà tots els principals tipus de cèl·lules testiculars i revelà una reducció en l'expressió gènica i l'accessibilitat de la cromatina en espermàtides tardanes, d'acord amb la condensació de la cromatina i la silenciació de l'expressió característics de l'espermatogènesi tardana. Els pics ATAC estaven enriquits vora Transcription Start Sites i gens altament expressats. Dels 3.114 polimorfismes d'un sol nucleòtid (SNP) heterozigots investigats, 773 mostraren desequilibri en la representació al·lèlica a nivell del recompte de seqüencies en espermàtides, que són cèl·lules haploides. Aquest desequilibri al·lèlic pot indicar diferències en la proporció de cèl·lules haploides que porten cada al·lel o variacions en l'expressió gènica o en l'accessibilitat de la cromatina. Es van genotipar in silico vuitanta SNPs en espermàtides i es va comptar el nombre de cèl·lules que portaven cada al·lel. Cinquanta-quatre SNPs van mostrar desequilibri en la representació al·lèlica a nivell del recompte cèl·lular, suggerint un possible efecte al·lèlic en la supervivència de les espermàtides.

La producción porcina se enfrenta a desafíos importantes en el ámbito reproductivo, cruciales para la eficiencia de los programas de inseminación artificial. La calidad del semen varía considerablemente entre verracos, lo que hace esencial comprender mejor la base molecular de la función espermática. Es pues necesario identificar marcadores moleculares que influyan en las características espermáticas. Los estudios presentados en esta tesis exploran los mecanismos moleculares subyacentes a la criotolerancia espermática, un parámetro clave para el sector porcino, la arquitectura funcional del genoma espermático y la supervivencia de las espermátides. En el artículo I, evaluamos el efecto de la purificación de eyaculados de cerdo con BoviPure™ sobre el transcriptoma espermático. El análisis de RNA-Seq y la expresión diferencial entre eyaculados purificados y no purificados mostraron una alta similitud entre grupos. Sin embargo, 372 genes presentaron una abundancia diferencial de RNA. La lista de genes diferencialmente abundantes incluía genes epidídimo-específicos, lo que sugiere la purificación eliminó células epiteliales epididimarias, vesículas extracelulares epididimarias o espermatozoides que habían incorporado RNAs epididimarios. En el artículo II, se realizaron un GWAS y un RNA-Seq (RNA total y pequeño) en 99 y 20 eyaculados de semen, respectivamente, cada uno proveniente de un verraco Pietrain diferente. El objetivo era identificar factores genéticos y transcriptómicos que influyeran en la criotolerancia espermática en porcinos. Identificamos una asociación GWAS en el cromosoma 12. El análisis de RNA identificó 13 genes cuyos niveles de RNA variaban según la criotolerancia espermática. Estos genes estaban principalmente relacionados con el estrés oxidativo y la función mitocondrial. En el artículo III, caracterizamos la estructura de la cromatina de los espermatozoides porcinos mediante el mapeo de las fracciones de cromatina mono- y sub-nucleosómica en dos muestras, empleando la nucleasa micrococcal y secuenciación de alto rendimiento (MNase-Seq). El análisis identificó 25,293 picos mono-nucleosómicos y 4,239 sub-nucleosómicos, observándose una conservación posicional entre cerdos y humanos en regiones genómicas relacionadas con el desarrollo. Los análisis de ontología génica y de los motivos de factores de transcripción revelaron asociaciones con la función espermática y la embriogénesis, destacando el motivo para el factor de transcripción ZNF263, relacionado con la regulación de la expresión paternal en embriones. En el artículo IV, el primer objetivo fue obtener los mapas genómicos funcionales (expresión génica y accesibilidad de la cromatina), indicativos de elementos reguladores activos (promotores, enhancers), para los diferentes tipos celulares presentes en el testículo porcino. El segundo objetivo fue identificar variantes genéticas que pudieran influir en la supervivencia de las espermátides. Utilizamos la tecnología de single-cell multiome ATAC + Gene Expression para secuenciar el transcriptoma y la cromatina accesible de 18,550 células de cuatro verracos Large White adultos. El análisis identificó los principales tipos celulares testiculares y reveló una reducción en la expresión génica y la accesibilidad de la cromatina en las espermátides tardías, en línea con la condensación de la cromatina y el apagado de la expresión característicos de la espermatogénesis tardía. Los picos de ATAC se enriquecieron cerca de los sitios de inicio de la transcripción y en genes altamente expresados. De los 3,114 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) heterocigotos investigados, 773 mostraron un desequilibrio en la representación alélica a nivel del recuento de secuencias en las espermátides, que son células haploides. Este desequilibrio alélico podría indicar diferencias en la proporción de células haploides que portan cada alelo o variaciones en la expresión génica o accesibilidad de la cromatina. Ochenta SNPs fueron genotipados in silico, y se contó el número de células que portaban cada alelo. Cincuenta y cuatro SNPs mostraron desequilibrio alélico a nivel del recuento celular, lo que sugiere un posible efecto alélico en la supervivencia de las espermátides.

Pig breeding faces significant challenges in reproductive performance, which is crucial for the efficiency of artificial insemination (AI) programs. Semen quality can vary widely between boars, making it essential to understand the genetic and molecular basis of sperm function. Research is vital to identify markers influencing sperm traits. The studies presented in this thesis aim to address these challenges by exploring the molecular mechanisms underlying sperm cryo-tolerance, an important sperm parameter for the pig production sector, the functional architecture of the porcine sperm genome, and spermatid survival. In paper I, we sought to evaluate effect on the pig sperm transcriptome of purifying ejaculates with BoviPure™. RNA-Seq followed by differential expression analysis of purified and non-purified ejaculates showed high similarity between groups, yet, 372 genes displayed differential RNA abundance. The list of differentially abundant genes was enriched with epididymis-specific genes, suggesting that the purification process removed either epididymal epithelial cells, epididymal extracellular vesicles, or sperm cells that had incorporated epididymal RNAs. In paper II, a Genome-wide Association Scan (GWAS) and RNA-Seq (total RNA and small RNA) analysis were performed on 99 and 20 sperm ejaculates, respectively, each from a different Pietrain boar, to identify genetic and transcriptomic factors influencing sperm cryo-tolerance in swine. We identified a GWAS hit on chromosome 12 and 13 genes which RNA levels varied according to sperm cryo-tolerance. These genes were mainly related to oxidative stress and mitochondrial function. In paper III, we characterize the chromatin structure of pig spermatozoa by mapping the location of mono- and sub-nucleosomal chromatin fractions from two samples using micrococcal nuclease digestion coupled with high-throughput sequencing. The analysis allowed identifying 25,293 mono-nucleosomal and 4,239 sub-nucleosomal peaks, with positional conservation observed between pigs and humans in development-related genomic regions. Gene ontology and transcription factor motif enrichment analyses revealed associations with sperm function and embryogenesis, notably highlighting the ZNF263 motif, a transcription factor that has been linked to the regulation of paternally preferential gene expression in early embryos. In paper IV, the first aim was to obtain the functional genomic maps of gene expression and chromatin accessibility – indicative of active regulatory elements such as promoters or enhancers – for the different cell types present in the pig testicle. The second aim was to identify genetic variants potentially influencing spermatid survival. We employed single-cell multiome ATAC + Gene Expression technology to sequence the transcriptome and accessible chromatin of 18,550 cells from four adult Large White boars. The analysis led to the identification of all known major testicular cell types and revealed that gene expression and chromatin accessibility were significantly reduced in late spermatids, consistent with the chromatin condensation and expression shutdown characteristic of late spermatogenesis. ATAC peaks were enriched near transcription start sites and highly expressed genes. Out of 3,114 heterozygous single nucleotide polymorphisms (SNPs) that were interrogated, 773 showed allelic representation imbalance at the sequencing read count level in spermatids, which are haploid cells. This allelic imbalance may indicate differences in the proportion of haploid cells carrying each allele or variations in gene expression (RNA levels) or chromatin accessibility (ATAC peaks). Eighty SNPs were in silico genotyped in the haploid cells and the number of cells carrying each allele was counted. Fifty-four SNPs showed allelic representation imbalance at the cell count level, suggesting a potential allelic effect on spermatid survival.