Characterization of lysosomal dysfunction in Parkinson’s disease associated with GBA1 mutations and development of new therapeutic strategies using pharmacological chaperones

Abstract

La malaltia de Parkinson (MP) és la segona malaltia neurodegenerativa més comuna, amb una rellevància creixent en una societat envellida. Els trets histopatològics característics de la MP inclouen la neurodegeneració de les neurones dopaminèrgiques en la via nigroestriatal i la presència d’inclusions proteiques que contenen α-sinucleïna. Actualment, el factor de risc genètic més alt per desenvolupar la MP és la presència de mutacions en el gen GBA1, que codifica l'enzim lisosomal glucocerebrosidasa (GCase). S'ha demostrat una relació entre la pèrdua d’activitat de GCase i l’acumulació d’α-sinucleïna en diversos models de la MP, tant in vivo com in vitro, així com en mostres obtingudes de pacients amb MP. Tot i que s'han proposat alguns mecanismes per explicar aquesta relació, el coneixement sobre les mutacions en GBA1 i el desenvolupament de la MP encara és incomplet, apuntant cap a efectes deguts tant a la pèrdua de funció de l'enzim com al guany de funció de les proteïnes mutants. Sembla que la disfunció en les vies lisosomals autofàgiques, que també ha estat descrita en el context de la MP, juga un paper clau en el procés de neurodegeneració. La nostra hipòtesi és que la restauració de l'activitat lisosomal la modulació de la GCase podria ser una estratègia terapèutica prometedora en pacients amb MP. En els darrers anys, la modulació de la GCase en el context de models de MP ha mostrat resultats prometedors a l’hora de revertir l’acumulació d’α-sinucleïna i prevenir la mort de les cèl·lules dopaminèrgiques. Utilitzant un model de MP amb neurones dopaminèrgiques que expressen formes salvatges o mutants de GCase, proposem l'ús de petites molècules com a xaperones al·lostèriques per estabilitzar la GCase mutant retinguda al reticle endoplasmàtic (RE) i ajudar el seu trànsit cap al lisosoma per restaurar l'activitat enzimàtica de la GCase. Això podria ajudar a millorar la funció global dels lisosomes i de l’autofàgia, promovent la eliminació de l’α-sinucleïna i reduint l'estrès del RE causat per la presència de GCase mutant mal plegada. Un conjunt de xaperones de GCase van ser generades per Gain Therapeutics i avaluades en el nostre model neuronal, en funció de la seva capacitat per restaurar els nivells de proteïna GCase i la seva activitat enzimàtica. Les molècules més prometedores van ser seleccionades per a una caracterització exhaustiva dels seus efectes en l'estat global de les cèl·lules, incloent-hi la funció i localització subcel·lular de la GCase, l'acumulació d’α-sinucleïna i substrats de la GCase, i la funció lisosomal i autofàgica. Es van provar dos compostos in vivo per a la validació dels potencials efectes terapèutics de les molècules. La caracterització exhaustiva dels dos compostos va identificar una molècula amb resultats prometedors, especialment pel que fa a la restauració de la presència i activitat de la proteïna GCase, així com en la millora de la viabilitat cel·lular. No obstant això, no es van observar millores significatives en la funció lisosomal i autofàgica, l'estrès del RE ni l'estrès oxidatiu. Els estudis preliminars in vivo en un model tòxic de MP van revelar el potencial del compost per augmentar l'activitat enzimàtica de la GCase i reduir l'acumulació dels seus substrats en àrees cerebrals rellevants per a la MP i òrgans perifèrics, alhora que es va observar una protecció lleu contra la neurodegeneració de la via nigroestriatal. Es necessiten estudis addicionals per confirmar el potencial terapèutic del compost en el context de la MP.

La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más común, con una relevancia creciente en nuestra sociedad envejecida. Las características histopatológicas de la EP incluyen la neurodegeneración de las neuronas dopaminérgicas en la vía nigroestriatal y la presencia de inclusiones proteicas que contienen α-sinucleína. Actualmente, el mayor factor de riesgo genético para desarrollar la EP es la presencia de mutaciones en el gen GBA1, que codifica la enzima lisosomal glucocerebrosidasa (GCase). Se ha demostrado una relación entre la pérdida de actividad de GCase y la acumulación de α-sinucleína en varios modelos de EP, tanto in vivo como in vitro, así como en muestras obtenidas de pacientes con EP. Aunque se han propuesto algunos mecanismos para explicar esta relación, el conocimiento sobre las mutaciones en GBA1 y el desarrollo de la EP sigue siendo incompleto, apuntando a efectos debidos tanto a la pérdida de función de la enzima como al aumento de función de las proteínas mutantes. Parece que la disfunción en las vías autofágicas lisosomales, que también ha sido descrita en el contexto de la EP, desempeña un papel clave en el proceso de neurodegeneración. Nuestra hipótesis es que la restauración de la actividad lisosomal mediante la modulación de GCase podría ser una estrategia terapéutica prometedora en pacientes con EP. En los últimos años, la modulación de GCase en el contexto de modelos de EP ha mostrado resultados prometedores en términos de revertir la acumulación de α-sinucleína y prevenir la muerte de las células dopaminérgicas. Utilizando un modelo de EP con neuronas dopaminérgicas que expresan formas silvestres o mutantes de GCase, proponemos el uso de pequeñas moléculas con función de chaperonas alostéricas para estabilizar la GCase mutante retenida en el retículo endoplásmico (RE) y ayudar a su tránsito hacia el lisosoma para restaurar la actividad enzimática de GCase. Esto podría ayudar a mejorar la función global de los lisosomas y la autofagia, promoviendo la eliminación de α-sinucleína y reduciendo el estrés del RE causado por la presencia de GCase mutante mal plegada. Un conjunto de chaperonas de GCase fueron generadas por Gain Therapeutics y evaluadas en nuestro modelo neuronal, según su capacidad para restaurar los niveles de proteína GCase y su actividad enzimática. Las moléculas más prometedoras fueron seleccionadas para una caracterización exhaustiva de sus efectos en el estado global de las células, incluyendo la función y localización subcelular de GCase, la acumulación de α-sinucleína y sustratos de GCase, y la función lisosomal y autofágica. Se probaron dos compuestos in vivo para validar los posibles efectos terapéuticos de las moléculas. La caracterización exhaustiva de los dos compuestos identificó una molécula con resultados prometedores, especialmente relativo a la restauración de la presencia y actividad de la proteína GCase, así como en la mejora de la viabilidad celular. Sin embargo, no se observaron mejoras significativas en la función lisosomal y autofágica, el estrés del RE ni el estrés oxidativo. Los estudios preliminares in vivo en un modelo tóxico de EP revelaron el potencial del compuesto para aumentar la actividad enzimática de GCase y reducir la acumulación de sus sustratos en áreas cerebrales relevantes y órganos periféricos, al mismo tiempo que se observó una ligera protección contra la neurodegeneración de la vía nigroestriatal. Se necesitan estudios adicionales para confirmar el potencial terapéutico del compuesto en el contexto de la EP.

Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease, with an increasing relevance in our aging society. Histopathological hallmarks of PD include neurodegeneration of the dopaminergic neurons in the nigrostriatal pathway and presence of protein inclusions containing α-synuclein. Currently the highest genetic risk factor to develop PD is the presence of mutations in the GBA1 gene, which encodes the lysosomal enzyme glucocerebrosidase (GCase). A relationship between loss of GCase activity and accumulation of α-synuclein has been demonstrated in multiple in vivo and in vitro PD models, as well as samples obtained from PD patients. Although some mechanisms to explain this relationship have been proposed, the knowledge behind GBA1 mutations and development of PD still remains incomplete, pointing towards effects due to both loss-of-function of the enzyme and gain-of-function of the mutant proteins. It seems that impairment in the autophagic lysosomal pathways (ALP), which has also been described in the context of PD, plays a key role in the neurodegeneration process. Our hypothesis is that restoration of lysosomal activity by targeting GCase could be a promising therapeutic strategy in PD patients. In recent years, modulation of GCase in the context of PD models has shown promising results in terms of reverting accumulation of α-synuclein and preventing dopaminergic cell death. Using a PD model of dopaminergic-like neurons expressing wild type or mutant forms of GCase, we propose the use of small-molecule allosteric chaperones to stabilize mutant GCase retained in the endoplasmic reticulum (ER) and help its transit to the lysosome to restore GCase enzymatic activity. This might help improve global lysosomal and autophagic function, promoting α-synuclein clearance, while reducing the ER stress caused by the presence of misfolded mutant GCase. A set of GCase chaperones were generated by Gain Therapeutics and screened in our neuronal model, according to their capacity to restore GCase protein levels and enzymatic activity. Selection of the most promising molecules allowed for an exhaustive characterization of their effects in global cell state, including GCase function and subcellular location, accumulation of α-synuclein and GCase substrates, lysosomal and autophagic function. Two compounds were tested in vivo for a validation of the potential therapeutic effects of the molecules. In-depth characterization of the two compounds identified a molecule with promising results, notably in restoring GCase protein presence and activity as well as improving cell viability. However, no significant improvements on lysosomal and autophagic function, ER stress nor oxidative stress were found. In vivo preliminary studies in a toxic PD model revealed the potential of the compound to increase GCase enzymatic activity and reduce accumulation of its substrates in relevant brain areas and peripheral organs, while mildly protecting against neurodegeneration of the nigrostriatal pathway. Further studies are warranted to confirm the compound's therapeutic potential in the context of PD.