Development of a novel therapy for ARDS based on the identification of miRNAs from mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles

Abstract

La síndrome de dificultat respiratòria aguda (SDRA) és una insuficiència respiratòria aguda hipoxèmica causada per una lesió pulmonar inflamatòria difusa, que afecta el 10% dels pacients a la UCI mundialment. La fisiopatologia implica l'activació i desregulació de múltiples vies de resposta al dany, que varien segons la etiologia de la lesió inicial i la resposta immunitària de l'individu, dificultant, així el diagnòstic i el tractament. Malgrat els avenços en la subfenotipificació de pacients i les cures de suport, no existeix un tractament farmacològic definitiu que restauri la homeòstasi immunitària i regeneri la membrana alveolocapil·lar, crucial per a la funció pulmonar. A més, l'estructura afectada del pulmó en la SDRA dificulta l'administració de fàrmacs, afectant la seva efectivitat.

Les cèl·lules mare mesenquimals (MSCs) tenen propietats regeneratives, immunomoduladores i antimicrobianes, mostrant potencial en models preclínics de lesió pulmonar aguda (ALI) i seguretat en assajos clínics. No obstant això, la translació d'aquestes a la clínica segueix sent un repte. Les MSCs exerceixen els seus efectes terapèutics principalment a través de l'activitat paracrina, mediada per vesícules extracel·lulars (VE), les quals s'han proposat com una alternativa prometedora a l'administració de MSCs. No obstant això, la utilització de les VE també presenta desafiaments per la seva aplicació clínica com els efectes pleiotròpics, problemes de reproduïbilitat i dificultats en la producció a gran escala.

Aquesta tesi busca identificar els miRNAs més efectius dins de les VE derivades de MSCs i caracteritzar un sistema d'administració pulmonar per desenvolupar una teràpia que regeneri el teixit pulmonar i moduli la resposta immunitària en la SDRA. La investigació es presenta a través d'estudis individuals.

El primer estudi demostra que les VE derivades de MSCs milloren l'estructura pulmonar i redueixen la inflamació en un model preclínic de lesió pulmonar aguda (LPA). Quan les MSCs s'estimulen amb lipopolisacàrid (LPS), es potencia l'efecte terapèutic de les seves VE (LPS-VE), mostrant un major efecte regeneratiu sobre les cèl·lules epitelials alveolars (AECs) i reduint la ràtio M1/M2 en macròfags THP-1 després de la infecció per Pseudomonas aeruginosa en comparació amb les VE de MSCs no estimulades (C-VE). Les LPS-VE també disminueixen l'activitat quimiotàctica dels macròfags alveolars, reduint el reclutament de neutròfils a l'espai alveolar.

L'estimulació amb LPS altera els perfils de miRNAs, amb miRNAs implicats en vies clau que regulen la resposta immunitària, l'apoptosi i la proliferació d'AECs i cèl·lules endotelials, processos fonamentals en la SDRA. Es van identificar miRNAs sobreexpressats, com miR-297, miR-93-5p i let-7b-5p, com a possibles mediadors dels efectes millorats de les LPS-VE. La transfecció individual d'aquests miRNAs en cèl·lules THP-1 redueix l'expressió de citoquines proinflamatòries induïdes per Pseudomonas aeruginosa, però quan s'administren simultàniament, promouen la polarització de macròfags cap a un fenotip antiinflamatori M2.

Per superar els reptes en l'administració de fàrmacs a nivell pulmonar, es van comparar dos nanotransportadors d'àcid poli(làctic-co-glicòlic) (PLGA), un amb càrrega positiva i un altre negativa. Ambdós mostren una excel·lent estabilitat col·loïdal i no mostren efectes tòxics ni en AECs ni en macròfags, cèl·lules target en la teràpia de la SDRA. Les nanocàpsules amb càrrega negativa mostren una captació més ràpida i una major acumulació cel·lular que les catiòniques. Quan s'administren per instil·lació intratraqueal, les nanocàpsules aniòniques es distribueixen uniformement en els lòbuls pulmonars, minimitzant la dispersió sistèmica i confirmant una captació efectiva per AECs i macròfags.

Amb la identificació de miR-297, miR-93-5p i let-7b-5p com a mediadors clau dels efectes terapèutics de les LPS-VE i la caracterització d'un vehicle adequat per a l'administració pulmonar, aquesta tesi construeix les bases per desenvolupar una tractament basat en la teràpia cel·lular, però sense cèl·lules, per la SDRA, amb el potencial de convertir-se en un producte sempre disponible a peu de llit.

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es una insuficiencia respiratoria aguda hipoxémica causada por una lesión pulmonar inflamatoria difusa, afectando al 10% de los pacientes en la UCI a nivel mundial. La fisiopatología implica la activación y desregulación de múltiples vías de respuesta al daño, que varían según la etiologia de la lesión inicial y la respuesta inmunitaria del individuo, lo que dificulta el diagnóstico y tratamiento del SDRA. A pesar de los avances en la subfenotipificación de pacientes y cuidados de soporte, no existe un tratamiento farmacológico definitivo que restaure la homeostasis inmunitaria y regenere la membrana alveolocapilar, crucial para la función pulmonar. Además, la estructura pulmonar afectada en el SDRA dificulta la administración de fármacos, afectando su efectividad.

Las células madre mesenquimales (MSCs) poseen propiedades regenerativas, inmunomoduladoras y antimicrobianas, mostrando potencial en modelos preclínicos de lesión pulmonar aguda (LPA) y seguridad en ensayos clínicos. Sin embargo, su translación a la clínica sigue siendo un desafío. Las MSCs ejercen sus efectos terapéuticos principalmente a través de la actividad paracrina, mediada por vesículas extracelulares (VE), las cuales se han propuesto como una alternativa prometedora a la administración de MSCs. Sin embargo, el uso de las VE también presenta obstaculos para su aplicación clínica como, efectos pleiotrópicos, problemas de reproducibilidad y dificultades en la producción a gran escala.

Esta tesis busca identificar los miRNAs más efectivos dentro de las VE derivadas de MSCs y caracterizar un sistema de administración pulmonar para desarrollar una terapia que regenere el tejido pulmonar y module la respuesta inmunitaria en el SDRA.

El primer estudio demuestra que las VE derivadas de MSCs mejoran la estructura pulmonar y reducen la inflamación en un modelo preclínico de lesión pulmonar aguda (LPA). Cuando las MSCs se estimulan con lipopolisacárido (LPS), se potencia el efecto terapéutico de sus VE (LPS-VE), mostrando un mayor efecto regenerativo sobre las células epiteliales alveolares (AECs) y reduciendo la ratio M1/M2 en macrófagos THP-1 tras la infección por Pseudomonas aeruginosa en comparación con las VE de MSCs no estimuladas (C-VE). Las LPS-VE también disminuyen la actividad quimioatrayente de los macrófagos alveolares, reduciendo el reclutamiento de neutrófilos en el espacio alveolar.

La estimulación con LPS altera los perfiles de miRNAs, con miRNAs implicados en vías clave que regulan la respuesta inmunitaria, la apoptosis y la proliferación de AECs y células endoteliales, procesos fundamentales en el SDRA. Se identifican miRNAs sobreexpresados, como miR-297, miR-93-5p y let-7b-5p, como posibles mediadores de los efectos mejorados de las LPS-VE. La transfección individual de estos miRNAs en células THP-1 reduce la expresión de citoquinas proinflamatorias inducidas por Pseudomonas aeruginosa, pero cuando son administrados simultaneamente, promueven la polarización de macrófagos hacia un fenotipo antiinflamatorio M2.

Para superar los desafíos en la administración de fàrmacos a nivel pulmonar, se compararon dos nanotransportadores de ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA), uno con carga positiva y otro negativa. Ambos muestran excelente estabilidad coloidal y no muestran efectos tóxicos ni en AECs ni macrófagos, células target en la terapia del SDRA. Las nanocápsulas con carga negativa muestran una captación más rápida y una mayor acumulación celular que las catiónicas. Al administrarse por instilación intratraqueal, las nanocápsulas aniónicas se distribuyen uniformemente en los lóbulos pulmonares, minimizando la dispersión sistémica y confirmando una captación efectiva por AECs y macrófagos.

Esta tesis con la identificación de miR-297, miR-93-5p y let-7b-5p como mediadores clave de los efectos terapéuticos de las LPS-VE y la caracterización de un vehículo adecuado para la administración pulmonar, senta las bases para desarrollar una tratamiento basado en la terapia celular, sin células para el SDRA, con el potencial de convertirse en un producto siempre disponible a pie de cama.

Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) is an acute hypoxemic respiratory failure caused by diffuse inflammatory lung injury, affecting around 10% of ICU patients worldwide. The pathophysiology involves activation and dysregulation of multiple injury response pathways, which vary depending on the injury’s cause and the individual’s immune response. This variability hinders ARDS diagnosis and treatment. Despite advances, including patient subphenotyping and improved supportive care, no definitive pharmacological treatment exists to restore immune homeostasis and regenerate the alveolocapillary membrane, crucial for lung function. The complex lung structure in ARDS further complicates drug delivery, affecting treatment effectiveness.

Mesenchymal stem cells (MSCs) possess regenerative, immunomodulatory, and antimicrobial properties, showing promise in preclinical acute lung injury (ALI) models and safety in clinical trials. However, translating these findings into clinical treatments remains challenging. MSCs primarily exert their therapeutic effects through paracrine activity, mediated by extracellular vesicles (EVs). Consequently, MSCs-derived EVs have emerged as a potential alternative to MSCs administration, addressing some clinical application challenges. Nonetheless, MSCs-EVs also face hurdles such as pleiotropic effects, reproducibility issues, and difficulties in large-scale production under GMP conditions.

This thesis aims to identify the most effective miRNAs within MSCs-derived EVs and characterize a pulmonary delivery system to create a novel therapy that regenerates lung tissue and modulates the immune response in ARDS. The research is presented through three individual publications that tackle specific objectives to achieve this goal.

The first study shows that MSC-derived EVs improve lung architecture and reduce inflammation in a preclinical acute lung injury (ALI) model. When MSCs are primed with lipopolysaccharide (LPS), the therapeutic effect of their EVs is enhanced. LPS-primed EVs (LPS-EVs) display a greater regenerative effect on alveolar epithelial cells (AECs) and uniquely reduce the M1/M2 macrophage ratio after Pseudomonas aeruginosa infection compared to EVs from naïve MSCs (C-EVs). LPS-EVs also reduce alveolar macrophages' chemoattractant activity, thereby decreasing neutrophil recruitment in the alveolar space.

LPS-priming alters the miRNA profiles of MSCs-derived EVs, with differentially expressed miRNAs implicated in critical pathways regulating immune response, differentiation, apoptosis, proliferation of AECs, endothelial cells, and barrier integrity—key processes in ARDS. Overexpressed miRNAs, including miR-297, miR-93-5p, and let-7b-5p, are identified as potential mediators of the enhanced effects of LPS-EVs. The individual transfection of these miRNAs into THP-1 cells reduces the expression of proinflammatory cytokines induced by Pseudomonas aeruginosa. Interestingly, when they are administered simultaneously, they exert a synergistic immunomodulatory effect,further promoting macrophage polarization towards an anti-inflammatory M2 phenotype.

To overcome pulmonary drug delivery challenges, a comparative analysis of two poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanocarriers—one positively and one negatively charged—was conducted. Both types showed excellent colloidal stability and did not show toxic effects to AECs or macrophages, key cellular targets in ARDS therapy. Negatively charged nanocapsules (NCs) demonstrate faster uptake and greater cellular accumulation than cationic NCs. When delivered via intratracheal instillation, anionic NCs distribute uniformly across lung lobes, minimizing systemic spread and confirming effective uptake by AECs and macrophages.

This thesis, by the identification of miR-297, miR-93-5p, and let-7b-5p as crucial regulators for LPS-EVs' therapeutic effects and the characterization of a drug delivery vehicle suitable for pulmonary administration, lays the groundwork for developing a cell-based, but cell-free ARDS therapy focused on tissue regeneration and restoring immune homeostasis. The proposed therapy has the potential to be a product available at any time at bedside.