Kidney fibrosis & Extracellular vesicles: harnessing their capacity as biomarkers and deciphering their functional mechanisms for therapeutic approaches

Abstract

Predir o diagnosticar la fibrosi renal per reduir el rebuig crònic en trasplantaments renals continua sent un gran repte. Els mètodes actuals, com la creatinina, la proteïnúria i la taxa de filtració glomerular tenen una precisió predictiva limitada, i el diagnòstic depèn encara de biòpsies renals, que són invasives i costoses. A més a més, la manca de fàrmacs antifibròtics efectius és un obstacle addicional. Per tant, és crucial identificar biomarcadors no invasius i noves dianes terapèutiques, així com desenvolupar teràpies avançades. Les vesícules extracel·lulars d’orina (uEV), que reflecteixen l'estat fisiopatològic del sistema genitourinari, han sorgit com una font prometedora de biomarcadors i una plataforma per abordar els riscos, els costos i les limitacions de mostreig de les biòpsies renals. A més a més, les EV amb potencial immunomodulador, com les derivades de cèl·lules mesenquimals estromals (MSC-EV), s'han proposat com a teràpia avançada per a la fibrosi renal. No obstant això, la seva aplicació clínica encara s'enfronta a reptes, especialment en la millora de dirigir-les i mantenir-les al teixit diana per aconseguir efectes terapèutics efectius, eficients i duradors. En aquesta tesi hem hipotetitzat que l'anàlisi molecular de les uEV podria portar a la identificació de biomarcadors i noves dianes terapèutiques per a la fibrosi renal. Addicionalment, hem hipotetitzat que els assajos in vitro utilitzats per estudiar les funcions de les MSC-EV administrades de manera local i els glicans –que juguen un paper clau en les interaccions cèl·lula a cèl·lula–, serien crucials per entendre les interaccions EV-cèl·lules, implicades en el targeting i en les funcions de les EV. El primer objectiu d'aquesta tesi va ser identificar proteïnes en uEV implicades en la fibrosi renal que poguessin explicar els nivells elevats d'un biomarcador prèviament identificat, la vitronectina (VTN). A més, es va intentar validar el potencial de la VTN com a biomarcador no invasiu per a la fibrosi renal en una nova cohort independent de pacients trasplantats de ronyó. Els resultats van confirmar aquest potencial de la VTN i van revelar que les proteïnes sobreexpressades en el grup fibròtic estaven associades amb la via fibrinolítica i del TNF, amb els macròfags jugant un paper important en l'augment dels nivells de VTN. El segon objectiu era explorar el paper de les N-glicosilacions de les MSC-EV en la interacció de les MSC-EV amb cèl·lules endotelials, centrant-se en les seves propietats immunomoduladores i regeneratives. Així, primer es va avaluar el potencial de l'assaig de migració de gotes d'agarosa com a model in vitro per mesurar la capacitat quimiotàctica de les EV alliberades localment. Aquest mètode, juntament amb altres assajos funcionals com ara l’assaig de formació de tubs i un sistema de flux basat en xips, es van utilitzar per investigar el paper de les N-glicosilacions de les MSC-EV en la seva captura i funcions. Les troballes posen de manifest que les N-glicosilacions són crucials per a una interacció efectiva de les MSC-EV amb les cèl·lules endotelials i per a regular l'angiogènesi, la migració cel·lular, el rolling i l'extravasació. Concretament, es va trobar que els N-glicans de les EV eren essencials per a una immunomodulació efectiva dels monòcits a través de l'eix MCP-1/CCR2. En general, els resultats destaquen el potencial de la glicoenginyeria per a millorar el targeting de les EV i la seva eficàcia terapèutica. En conclusió, aquesta tesi demostra el potencial de les EV com a biomarcadors i eines terapèutiques per a la fibrosi renal. Proporciona nous coneixements sobre els mecanismes moleculars que impulsen la fibrosi renal, introdueix mètodes innovadors per avaluar la funcionalitat de les EV administrades localment i ofereix noves perspectives sobre el targeting i els mecanismes d'acció de les MSC-EV.

Predecir o diagnosticar la fibrosis renal para reducir el rechazo crónico en trasplantes renales sigue siendo un gran desafío. Los métodos actuales, como la creatinina, la proteinuria y la tasa de filtración glomerular, tienen una precisión predictiva limitada, y el diagnóstico todavía depende de biopsias renales, que son invasivas y costosas. Además, la falta de fármacos antifibróticos efectivos es un obstáculo adicional. Por lo tanto, es crucial identificar biomarcadores no invasivos y nuevas dianas terapéuticas, así como desarrollar terapias avanzadas.

Las vesículas extracelulares de orina (uEV), que reflejan el estado fisiopatológico del sistema genitourinario, han surgido como una fuente prometedora de biomarcadores y una plataforma para abordar los riesgos, los costos y las limitaciones de muestreo de las biopsias renales. Además, las EV con potencial inmunomodulador, como las derivadas de células mesenquimales estromales (MSC-EV), se han propuesto como terapia avanzada para la fibrosis renal. No obstante, su aplicación clínica aún enfrenta desafíos, especialmente en la mejora de su direccionamiento y mantenimiento en el tejido diana para lograr efectos terapéuticos efectivos, eficientes y duraderos.

En esta tesis hemos hipotetizado que el análisis molecular de las uEV podría llevar a la identificación de biomarcadores y nuevas dianas terapéuticas para la fibrosis renal. Adicionalmente, hemos hipotetizado que los ensayos in vitro utilizados para estudiar las funciones de las MSC-EV administradas de manera local y los glicanos –que juegan un papel clave en las interacciones célula a célula– serían cruciales para entender las interacciones EV-células, implicadas en el targeting y en las funciones de las EV.

El primer objetivo de esta tesis fue identificar proteínas en uEV implicadas en la fibrosis renal que pudieran explicar los niveles elevados de un biomarcador previamente identificado, la vitronectina (VTN). Además, se intentó validar el potencial de la VTN como biomarcador no invasivo para la fibrosis renal en una nueva cohorte independiente de pacientes trasplantados de riñón. Los resultados confirmaron este potencial de la VTN y revelaron que las proteínas sobreexpresadas en el grupo fibrótico estaban asociadas con la vía fibrinolítica y del TNF, con los macrófagos jugando un papel importante en el aumento de los niveles de VTN.

El segundo objetivo era explorar el papel de las N-glicosilaciones de las MSC-EV en la interacción de las MSC-EV con células endoteliales, centrándose en sus propiedades inmunomoduladoras y regenerativas. Así, primero se evaluó el potencial del ensayo de migración de gotas de agarosa como modelo in vitro para medir la capacidad quimiotáctica de las EV liberadas localmente. Este método, junto con otros ensayos funcionales como el ensayo de formación de tubos y un sistema de flujo basado en chips, se utilizó para investigar el papel de las N-glicosilaciones de las MSC-EV en su captura y funciones. Los hallazgos destacan que las N-glicosilaciones son cruciales para una interacción efectiva de las MSC-EV con las células endoteliales y para regular la angiogénesis, la migración celular, el rolling y la extravasación. Concretamente, se encontró que los N-glicanos de las EV eran esenciales para una inmunomodulación efectiva de los monocitos a través del eje MCP-1/CCR2. En general, los resultados subrayan el potencial de la glicoingeniería para mejorar el targeting de las EV y su eficacia terapéutica.

En conclusión, esta tesis demuestra el potencial de las EV como biomarcadores y herramientas terapéuticas para la fibrosis renal. Proporciona nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares que impulsan la fibrosis renal, introduce métodos innovadores para evaluar la funcionalidad de las EV administradas localmente y ofrece nuevas perspectivas sobre el targeting y los mecanismos de acción de las MSC-EV.

Predicting or diagnosing renal fibrosis to reduce chronic allograft loss remains a major challenge in kidney transplantation. Current methods, such as creatinine levels, proteinuria, and glomerular filtration rate, have limited predictive accuracy, and diagnosis still relies on costly and invasive kidney biopsies. Additionally, the absence of effective antifibrotic drugs presents another significant hurdle. Therefore, identifying non-invasive biomarkers and new therapeutic targets, along with developing advanced therapies, is of paramount importance. In this context, urinary extracellular vesicles (uEV), which mirror the pathophysiological state of the genitourinary system, have emerged as a promising source of biomarkers and a platform to address the risks, costs, and sampling limitations of renal biopsies. Moreover, EV with immunomodulatory potential, such as those derived from mesenchymal stromal cells (MSC-EV), have been proposed as advanced therapies for kidney fibrosis among other pathologies. However, their clinical application still faces challenges, particularly in improving targeting and homing to achieve effective, efficient, and long-lasting therapeutic effects. In this thesis we hypothesized that molecular analysis of urinary extracellular vesicles (uEV) could lead to the identification of biomarkers and new therapeutic targets for kidney fibrosis. Additionally, we hypothesized that in vitro assays used to study the functions of locally delivered MSC-EV and glycans—which play a key role in cell-to-cell interactions—would be crucial in understanding the EV-cell interactions involved in EV homing and functions. The first aim of this thesis was to identify proteins in uEV involved in kidney fibrosis that could explain the elevated levels of a previously identified biomarker, vitronectin (VTN). Furthermore, it sought to validate VTN's potential as a non-invasive biomarker for kidney fibrosis in a new independent cohort of kidney transplant patients. The results confirmed VTN's potential, and revealed that the overexpressed proteins in the fibrotic group were primarily associated with the fibrinolytic and TNF pathways, with macrophages playing a significant role in the increased VTN levels. The second aim was to explore the role of MSC-EV N-glycosylation in MSC-EV interaction with endothelial cells, focusing on their immunomodulatory and regenerative properties. Thus, we first evaluated the potential of the agarose spot migration assay as an in vitro model to measure the chemoattractant capacity of locally delivered EV. This method, along with other functional assays such as the tube formation assay and a chip-based flow system, was then used to investigate the role of MSC-EV N-glycosylation in EV uptake and function. The findings highlight that N-glycosylation is crucial for effective MSC-EV interaction with endothelial cells and for regulating angiogenesis, cell migration, rolling, and extravasation. Specifically, N-glycans were found to be essential for effective EV-mediated immunomodulation of monocyte rolling and transmigration through the MCP-1/CCR2 axis. Overall, the results underscore the potential of glycoengineering to enhance EV targeting and therapeutic efficacy, while emphasizing the importance of preserving key glycosylation features. In conclusion, this thesis demonstrates the potential of EV as biomarkers and therapeutic tools for kidney fibrosis. It provides new insights into the molecular mechanisms driving kidney fibrosis, introduces innovative methods for assessing the functionality of locally administered EV, and offers new perspectives on the targeting and mechanisms of action of MSC-EV.