Novel experimental models to study amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia

Abstract

L'esclerosi lateral amiotròfica (ELA) i la demència frontotemporal (DFT) són malalties neurodegeneratives que representen dos extrems d'un espectre continu de malalties, compartint característiques patològiques i genètiques, malgrat manifestar-se principalment com a símptomes motors en l'ELA i símptomes conductuals en la DFT. Comprendre adequadament els seus mecanismes patogènics és crucial per a desenvolupar nous enfocaments terapèutics. No obstant això, un obstacle important per al progrés en aquest camp és l'escassa translació de les troballes dels models animals a les aplicacions clíniques, especialment evident en el fracàs de molts assajos clínics d'ELA. Aquest buit pot atribuir-se, en part, a les limitacions dels models experimentals actuals.

En aquesta tesi doctoral, primer ens centrem en les limitacions de la micròglia murina, a causa de les diferències específiques entre espècies. Promovent una recerca biomèdica basada en humans, vam editar una línia de cèl·lules mare embrionàries (ESC, de les sigles en anglès) humanes per a introduir la mutació causant d'ELA SOD1-G93A mitjançant la tecnologia de repeticions palindròmiques curtes agrupades regularment espaiades (CRISPR)/Cas9. El nostre objectiu era investigar si la mutació SOD1 afecta directament a diferents funcions microglials en micròglia derivada d’ESCs humanes in vitro. Vam observar que la mutació SOD1-G93A alterava el perfil de citocines en condicions basals, incrementava la resposta microglial a un estímul pro-inflamatori, deteriorava moderadament la funció fagocítica, provocava canvis metabòlics en condicions de no-estimulació i adaptava de manera diferent el seu metabolisme en resposta al lipopolisacàrid (LPS) en comparació amb la micròglia control.

En els últims anys, el desenvolupament de models de ratolins quimèrics amb micròglia humana ha sorgit com una eina prometedora per a comprendre millor la biologia microglial, ja que la micròglia humana empeltada en el sistema nerviós central (SNC) del ratolí imita d'una forma més acurada el transcriptoma de la micròglia humana primària en comparació amb la micròglia in vitro. Mentre que la majoria dels estudis publicats transplanten micròglia humana en el cervell del ratolí, nosaltres vam optar pel trasplantament en la medul·la espinal de ratolins nounats, ja que és més rellevant en el camp de l'ELA. L'administració de 50.000 progenitors microglials (MPs) a la regió caudal de la medul·la espinal de ratolins neonatals Rag2-/- IL2rγ-/- hCSF1-KI va resultar en una colonització robusta de micròglia humana (CD45+ P2RY12+) en tota la medul·la espinal, des de cervical a sacra, almenys fins a 10 mesos post-trasplantament. Centrant-nos en la medul·la espinal lumbar, vam observar que el quimerisme microglial humà augmentava amb el temps i aconseguia una major colonització en la substància blanca que en la substància grisa.

En l'últim capítol d'aquesta tesi doctoral, vam caracteritzar fenotípicament un model de ratolí C9orf72 generat recentment, knock-in per a 30 repeticions GGGGCC (G4C2) en el gen C9orf72 de ratolí. Encara que les mutacions C9ORF72 són la causa genètica més comuna d'ELA i DFT, els models de ratolí existents no han aconseguit recapitular completament els símptomes motors de l'ELA o les característiques conductuals de la DFT. Després de 18 mesos de seguiment, el nostre model de ratolí C9orf72 no va desenvolupar dèficits motors similars als de l'ELA. Per contra, els ratolins homozigots C9orf72 envellits van adquirir alguns dèficits conductuals relacionats amb la DFT, incloent-hi un comportament de tipus depressiu i una deterioració de la memòria.

En resum, aquesta tesi doctoral va caracteritzar diferents enfocaments experimentals nous per a avançar en la recerca en el camp de l'ELA i la FTD. Aquestes troballes proporcionen valuosos coneixements que poden ajudar a comprendre millor els mecanismes patogènics implicats en aquestes malalties, la qual cosa en última instància podria facilitar el desenvolupament de noves estratègies terapèutiques d'aquestes malalties neurodegeneratives.

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la demencia frontotemporal (DFT) son enfermedades neurodegenerativas que representan dos extremos de un espectro continuo de enfermedades, compartiendo características patológicas y genéticas, a pesar de manifestarse principalmente como síntomas motores en la ELA y síntomas conductuales en la DFT. Comprender adecuadamente sus mecanismos patogénicos es crucial para desarrollar nuevos enfoques terapéuticos. Sin embargo, un obstáculo importante para el progreso en este campo es la escasa traslación de los hallazgos de los modelos animales a las aplicaciones clínicas, especialmente evidente en el fracaso de muchos ensayos clínicos de ELA. Esta laguna puede atribuirse, en parte, a las limitaciones de los modelos experimentales actuales.

En esta tesis doctoral, primero nos centramos en las limitaciones de la microglía murina, debido a las diferencias específicas entre especies. Promoviendo una investigación biomédica basada en humanos, editamos células madre embrionarias (ESC, de las siglas en inglés) humanas para introducir la mutación causante de ELA SOD1-G93A mediante la tecnología de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente espaciadas (CRISPR)/Cas9. Nuestro objetivo era investigar si la mutación SOD1 afecta directamente a distintas funciones microgliales en microglía derivadas de ESCs humanas in vitro. Observamos que la mutación SOD1-G93A alteraba el perfil de citoquinas en condiciones basales, incrementaba la respuesta microglial a un estímulo proinflamatorio, deterioraba moderadamente la función fagocítica, provocaba cambios metabólicos en condiciones de no-estimulación y adaptaba de forma diferente su metabolismo en respuesta al lipopolisacárido (LPS) en comparación con la microglía control.

En los últimos años, el desarrollo de modelos de ratones quiméricos con microglía humana ha surgido como una herramienta prometedora para comprender mejor la biología microglial, ya que la microglía humana injertada en el sistema nervioso central (SNC) del ratón imita de una forma más adecuada el transcriptoma de la microglía humana primaria en comparación con la microglía in vitro. Mientras que la mayoría de los estudios publicados trasplantaron microglía humana en el cerebro murino, nosotros optamos por el trasplante en la médula espinal de ratones neonatos, ya que es más relevante en el campo de la ELA. La administración de 50.000 progenitores microgliales (MPs) en la región caudal de la médula espinal de ratones neonatales Rag2-/- IL2rγ-/- hCSF1-KI resultó en una colonización robusta de microglía humana (CD45+ P2RY12+) en toda la médula espinal, desde cervical a sacra, al menos hasta 10 meses post-transplante. Centrándonos en la médula espinal lumbar, observamos que el quimerismo microglial humano aumentaba con el tiempo y alcanzaba una mayor colonización en la sustancia blanca que en la sustancia gris.

En el último capítulo de esta tesis doctoral, caracterizamos fenotípicamente un modelo de ratón C9orf72 generado recientemente, knock-in para 30 repeticiones GGGGCC (G4C2) en el gen C9orf72 de ratón. Aunque las mutaciones C9ORF72 son la causa genética más común de ELA y DFT, los modelos de ratón existentes no han logrado recapitular completamente los síntomas motores de la ELA o las características conductuales de la DFT. Tras 18 meses de seguimiento, nuestro modelo de ratón C9orf72 no desarrolló déficits motores similares a los de la ELA. Por el contrario, los ratones homocigotos C9orf72 envejecidos adquirieron algunos déficits conductuales relacionados con la DFT, incluyendo un comportamiento de tipo depresivo y un deterioro de la memoria.

En resumen, esta tesis doctoral caracterizó distintos enfoques experimentales novedosos para avanzar en la investigación en el campo de la ELA y la FTD. Estos hallazgos proporcionan valiosos conocimientos que pueden ayudar a comprender mejor los mecanismos patogénicos implicados en estas enfermedades, lo que en última instancia podría facilitar el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas de estas enfermedades neurodegenerativas.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD) are neurodegenerative diseases that represents two ends of a continuous disease spectrum, sharing key pathological and genetic features, despite manifesting primarily as motor symptoms in ALS and behavioural symptoms in FTD. A proper understanding of their pathogenic mechanisms is crucial for developing new therapeutic approaches. However, a significant barrier to progress in this field is the poor translation of findings from animal models to clinical applications, particularly evident in the failure of many ALS clinical trials. This gap can be attributed, in part, to limitations in current experimental models.

In this PhD thesis, we first faced mouse microglia limitations due to species-specific differences. Shifting toward more human-based biomedical research, we edited a human embryonic stem cell (ESC) line to introduce the ALS-causing SOD1-G93A mutation by Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 technology. Our aim was to investigate whether the mutant SOD1 directly impacts distinct microglial functions in human ESC-derived microglia in vitro. We found that SOD1-G93A mutation altered the cytokine profile at baseline conditions, heightened the microglial response to a pro-inflammatory stimulus, moderately impaired phagocytic function, caused metabolic changes in unstimulated conditions, and adapted differently their metabolism in response to lipopolysaccharide (LPS) when compared to control microglia.

In the recent years, the development of chimeric mouse models with human microglia has emerged as a promising tool for better understanding microglial biology, since human microglia engrafted in the mouse central nervous system (CNS) mimic more closely the primary human microglial transcriptome compared to in vitro microglia. While most of studies xenotransplanted human microglia into the brain, thus we opted for transplantation into the neonatal mouse spinal cord as this is more relevant in the ALS field. We found that administration of 50,000 microglial progenitors (MPs) into the caudal spinal cord region of neonatal Rag2−/− IL2rγ−/− hCSF1-KI mice resulted in robust human microglia (CD45+ P2RY12+) colonization throughout all the spinal cord, from cervical to sacral, at least up to 10 months post-transplantation. Focusing on the lumbar spinal cord, we found that the human microglial chimerism increased over the time and reached higher colonization in the white matter than in grey matter.

In the last chapter of this PhD thesis, we characterized phenotypically a newly generated C9orf72 mouse model, knock-in for 30 GGGGCC (G4C2) repeats in the mouse C9orf72 gene. Although C9ORF72 mutations are the most common genetic cause of ALS and FTD, existing mouse models have failed to fully recapitulate the ALS motor symptoms or FTD behavioural features. We found that, after 18 months of follow up, our C9orf72 mouse model did not develop ALS-like motor deficits. In contrast, aged homozygous C9orf72 mice acquired some FTD-related behavioural deficits, including depressive-like behaviour and memory decline.

In summary, this doctoral thesis characterized distinct novel experimental approaches to advance the investigation in the ALS and FTD field. These findings provide valuable insights that may help to better understand the pathogenic mechanisms involved in these diseases, which ultimately could facilitate the development of new therapeutical strategies of these neurodegenerative diseases.