Evaluation of topoisomers of snake venom-derived peptides as potential antimicrobial and antitumor agents

Abstract

This thesis reports an investigation of the effect of topoisomeric modification on the activity of two peptides: crotalicidin (Ctn), a cathelicidin from the venom of a South American rattlesnake, and Ctn[15-34], a Ctn segment with interesting antimicrobial and antitumoral properties, as well as excellent serum stability. Topoisomeric refers to composition-identical (hence isomeric) yet three-dimensionally distinct (hence topo-) variants of a biomolecule where the structural maneuvers bring about potentially useful physiological effects. For peptides, the topoisomer term is often reserved to describe all-D-amino acid versions with sequences identical [i.e., enantio (e) form] or fully reversed [i.e., retroenantio (re)] relative to the native primary structure. To comprehensively assess the properties and activities of Ctn and Ctn[15-34] e and re topoisomers, I have compared them with both the parent peptide and its sequence-inverted variant [retro (r) form, also treated as a topoisomer]. While all topoisomers were active against gram-negative bacteria and tumor cells, those featuring D-amino acids were more cytotoxic than their L- counterparts towards normal cells. Even so, the higher stability of the e and re versions in human fluids prompted further exploration. Thus Ctn[15-34], Ctn re and Ctn[15-34] re were selected for an in vivo efficacy evaluation of their anti-infective potential in a murine model of Acinetobacter baumannii systemic infection. Following an in vivo toxicology study in CD1 mice, Ctn[15-34] re was deemed too toxic at the examined doses and excluded. For the remaining two topoisomers, Ctn[15-34] and Ctn re, a single intraperitoneal dose did not ensure mice survival. For Ctn[15-34] in particular, reasonably good results warranted further investigation despite some animals' deaths. Unfortunately, a three-day regimen of Ctn[15-34] intraperitoneal injections was lethal for all animals after the first day. Based on these results, this thesis is a sobering reminder that topoisomeric modification of bioactive peptides, which has proven quite succesful in several other cases, cannot be taken for granted to provide viable antimicrobial leads and must be therefore pursued with caution until confirmed by in vivo evidence. Aside from the unexpectedly adverse outcomes, the thesis illustrates a cogent approach for evaluating antimicrobial peptide topoisomeric leads from bench to in vivo infection model stages.

Aquesta tesi presenta un estudi sobre l'efecte de la modificació topoisomèrica en l'activitat de dos pèptids antimicrobians: la crotalicidina (Ctn), una catelicidina del verí d'una serp de cascavell sud-americana, i Ctn[15-34], un segment de Ctn amb propietats antimicrobianes i antitumorals interessants, així com una excel·lent estabilitat en sèrum. El terme topoisomeria fa referència a variants d'una biomolècula que són d’idèntica composició (isomeria) però tridimensionalment diferents (topo-), on les modificacions estructurals poden produir efectes fisiològics potencialment útils. En el cas dels pèptids, el terme topoisòmer s’utilitza sovint per descriure versions amb tots els aminoàcids en configuració D, amb seqüències idèntiques (forma enantio, e) o totalment invertides (forma retroenantio, re) respecte de l'estructura primària nativa. Per avaluar de manera exhaustiva les propietats i activitats dels topoisòmers Ctn i Ctn[15-34] en forma e i re, es van comparar amb el pèptid progenitor i amb la seva variant d'inversió de seqüència (forma retro, r), que també es considera un topoisòmer. Tot i que tots els topoisòmers mostraven activitat contra bacteris gramnegatius i cèl·lules tumorals, aquells amb aminoàcids en configuració D eren més citotòxics envers les cèl·lules normals que les versions amb aminoàcids en configuració L. Malgrat això, l'elevada estabilitat de les versions e i re en fluids humans va motivar una exploració més detallada. Per tant, es van seleccionar els topoisòmers Ctn[15-34], Ctn re i Ctn[15-34] re per a una avaluació in vivo del seu potencial antiinfecciós en un model murí d'infecció sistèmica per Acinetobacter baumannii. Després d’un estudi de toxicologia in vivo en ratolins CD1, es va determinar que Ctn[15-34] re era massa tòxic en les dosis examinades i es va excloure. Per als altres dos topoisòmers restants, Ctn[15-34] i Ctn re, una única dosi intraperitoneal no va garantir la supervivència dels ratolins. En particular, per a Ctn[15-34], els resultats van ser raonablement bons però es van observar morts en alguns animals. Malauradament, una administració de tres vegades al dia d’injeccions intraperitoneals amb Ctn[15-34] no va resultar eficient per a tots els animals. Basat en aquests resultats, aquesta tesi serveix com a recordatori clar que la modificació topoisomèrica de pèptids bioactius, que ha demostrat ser força reeixida en altres casos, no es pot assumir com a estratègia general per a obtenir compostos antimicrobians sense confirmació prèvia in vivo. A banda dels resultats adversos inesperats, la tesi suposa un enfocament sòlid per a avaluar candidats a pèptids antimicrobians des del laboratori fins a models d'infecció in vivo.