Fecal biomarkers of stress and welfare in captive lions (Panthera leo): development, validation, and insights into physiological regulation

Abstract

Les institucions zoològiques són responsables de garantir els més alts estàndards en benestar animal. En captivitat, els animals poden estar exposats a factors estressants relacionats amb l’allotjament i maneig que afectin negativament la seva salut i benestar. La mesura de glucocorticoides és una eina àmpliament utilitzada per monitoritzar l'estrès, amb l’anàlisi d’hormones en femtes com a mètode no invasiu habitual en endocrinologia de fauna salvatge. Malgrat el seu potencial, la fisiologia de l'estrès en lleons en captivitat ha estat poc estudiada, amb un enfoc principal en la reproducció més que en les respostes a les condicions ambientals i de maneig. A mesura que la ciència del benestar animal avança cap a promoure estats afectius positius, resulta fonamental investigar nous biomarcadors que permetin avaluar experiències de benestar positiu. L'oxitocina i la immunoglobulina A (IgA), vinculades als sistemes neuroendocrí i immunitari, respectivament, mostren potencial com a indicadors d'experiències positives. No obstant això, la presència d'oxitocina a les femtes encara no s’ha investigat i l’IgA en femtes no s'ha explorat en fèlids salvatges. Validar aquests biomarcadors és essencial abans d’integrar-los en avaluacions de benestar animal. Així doncs, aquesta tesi tenia per objectiu avançar en la comprensió de la fisiologia de l'estrès en lleons en captivitat (Panthera leo), amb un enfoc en el desenvolupament i validació de metodologies per quantificar oxitocina i IgA en femtes. Primer, vam examinar els nivells de metabòlits de glucocorticoides en femtes (FGM per les seves sigles en anglès) en lleons en condicions ambientals i de maneig estables. Mentre que el sexe no va tenir efecte, l'estat reproductiu sí: les lleones ovariectomitzades presentaven nivells de FGM més baixos que les femelles intactes i aquelles sota contracepció hormonal. També es van examinar condicions específiques d’allotjament i maneig, observant que els nivells de FGM variaven entre zoològics, amb la inestabilitat social i l'agressivitat relacionades amb una major activitat adrenocortical. Tanmateix, la variabilitat individual en les respostes a l'estrès remarca la importància d'un monitoratge individualitzat. La segona part d'aquesta tesi constitueix la primera investigació sobre la presència d'oxitocina en femtes en qualsevol espècie. Es va desenvolupar i validar amb èxit un protocol per a l’extracció i quantificació d’oxitocina en femtes de lleó mitjançant immunoassaig enzimàtic. Així mateix, es va validar una metodologia per extreure i quantificar IgA en femtes de lleons mitjançant immunoassaig enzimàtic. Després d’aquests avenços metodològics, es va realitzar una avaluació inicial de la rellevància biològica d'aquests biomarcadors mitjançant l'anàlisi de les seves concentracions en lleons en condicions socials i d’allotjament estables en captivitat. Els resultats van indicar que les concentracions d'IgA fecal van ser influenciades pel sexe, amb les femelles mostrant nivells més alts que els mascles, mentre que els nivells d'oxitocina fecal no es van veure afectats per factors biològics. Finalment, es va examinar la relació entre l'oxitocina i l'IgA amb el sistema d'estrès. Tot i que no es va trobar una correlació forta ni consistent entre l'oxitocina fecal i les concentracions de FGM, es va observar una relació positiva entre l’IgA fecal i els nivells de FGM en condicions basals. No obstant, aquesta correlació no es va mantenir de manera consistent entre els individus en analitzar les fluctuacions diàries en els nivells dels biomarcadors. En general, aquesta tesi contribueix a millorar la nostra comprensió de la fisiologia de l'estrès en lleons en captivitat i representa un primer pas fonamental en l’investigació de l'oxitocina i l’IgA en femtes com a biomarcadors del benestar animal. No obstant això, cal més investigació per avaluar aquests biomarcadors en relació amb els estats afectius positius i establir-ne la seva fiabilitat com a indicadors fisiològics en avaluacions de benestar.

Las instituciones zoológicas son responsables de garantizar los más altos estándares de bienestar animal. En cautividad, los animales pueden estar expuestos a factores estresantes relacionados con el alojamiento y manejo que afectan negativamente su salud y bienestar. La medición de glucocorticoides es una herramienta ampliamente utilizada para monitorear el estrés, siendo el análisis de hormonas en heces un método no invasivo habitual en endocrinología de fauna silvestre. A pesar de su potencial, la fisiología del estrés en leones en cautividad ha sido poco estudiada, con un enfoque principal en la reproducción más que en las respuestas a las condiciones ambientales y de manejo. A medida que la ciencia del bienestar animal avanza hacia la promoción de estados afectivos positivos, resulta fundamental investigar nuevos biomarcadores que permitan evaluar experiencias de bienestar positivo. La oxitocina y la inmunoglobulina A (IgA), relacionadas con los sistemas neuroendocrino e inmune, respectivamente, muestran potencial como indicadores de experiencias positivas. Sin embargo, la presencia de oxitocina en heces aún no ha sido explorada, y la IgA en heces no ha sido investigada en felinos silvestres. Validar estos biomarcadores es esencial antes de integrarlos en evaluaciones de bienestar animal. Así, esta tesis tuvo como objetivo avanzar en la comprensión de la fisiología del estrés en leones en cautividad (Panthera leo), con un enfoque en el desarrollo y validación de metodologías para cuantificar oxitocina e IgA en heces. Primero, examinamos los niveles de metabolitos de glucocorticoides en heces (FGM por sus siglas en inglés) en leones en condiciones ambientales y de manejo estables. Mientras que el sexo no tuvo efecto, el estado reproductivo sí: las leonas ovariectomizadas presentaron niveles de FGM más bajos que las hembras intactas y aquellas bajo contracepción hormonal. Seguidamente se examinaron condiciones específicas de alojamiento y manejo, observando que los niveles de FGM variaban entre zoológicos, con la inestabilidad social y la agresividad relacionadas con una mayor actividad adrenocortical. No obstante, la variabilidad individual en las respuestas al estrés resalta la importancia de un monitoreo individualizado. La segunda parte de esta tesis representa la primera investigación sobre la presencia de oxitocina en heces en cualquier especie. Se desarrolló y validó con éxito un protocolo para la extracción y cuantificación de oxitocina en heces de león mediante inmunoensayo enzimático. De manera similar, se validó una metodología para la extracción y cuantificación de IgA fecal en leones utilizando inmunoensayo enzimático. Tras estos avances metodológicos, se llevó a cabo una evaluación inicial de la relevancia biológica de estos biomarcadores en leones en cautividad bajo condiciones sociales y de alojamiento estables. Los resultados indicaron que las concentraciones de IgA fecal fueron influenciadas por el sexo, con las hembras mostrando niveles más altos que los machos, mientras que los niveles de oxitocina fecal no se vieron afectados por factores biológicos. Finalmente, se examinó la relación entre la oxitocina e IgA con el sistema de estrés. Aunque no se encontró una correlación fuerte ni consistente entre la oxitocina fecal y las concentraciones de FGM, se observó una relación positiva entre la IgA fecal y los niveles de FGM en condiciones basales. Sin embargo, esta correlación no se mantuvo de manera consistente entre los individuos al analizar las fluctuaciones diarias en los niveles de los biomarcadores. En general, esta tesis mejora nuestra comprensión de la fisiología del estrés en leones en cautividad y representa un primer paso fundamental en la investigación de la oxitocina y la IgA en heces como biomarcadores del bienestar animal. Sin embargo, se requiere más investigación para evaluar estos biomarcadores en relación con los estados afectivos positivos y establecer su fiabilidad como indicadores fisiológicos en evaluaciones de bienestar.

Zoological institutions are responsible for ensuring the well-being of animals in their care, maintaining the highest standards of animal welfare. In captivity, animals can be exposed to various stressors related to housing and management practices, which can negatively impact animal health and welfare. To monitor stress responses, glucocorticoids have long been used as key physiological indicators, helping identify factors and practices contributing to poor health, reduced reproductive success, and compromised welfare. Among non-invasive methods, fecal hormone analysis is widely utilized in wildlife endocrinology. Despite its potential, stress physiology in lions under human care remains underexplored, with most existing research focusing on reproductive physiology rather than stress responses to environmental and husbandry conditions. As animal welfare science shifts towards promoting positive affective states, new biomarkers are being explored to assess positive welfare experiences. Oxytocin and immunoglobulin A (IgA), linked to the neuroendocrine and immune systems, respectively, have shown promise as indicators of positive experiences. However, the presence of oxytocin in feces has not been previously investigated, and fecal IgA remains unexplored in wild felids. Therefore, validating these biomarkers in feces is essential before they can be reliably applied in animal welfare assessments. Accordingly, this thesis aimed to advance the understanding of stress physiology in captive lions (Panthera leo), with a particular focus on the development and validation of non-invasive methodologies for measuring oxytocin and IgA in feces as potential biomarkers of positive welfare. We first examined fecal glucocorticoid metabolite (FGM) concentrations in captive lions under stable environmental and management conditions to assess how they vary with biological factors. While sex had no effect, reproductive status in females influenced FGM levels, with ovariectomized lionesses exhibiting lower concentrations than intact and hormonally contracepted females. We then investigated the impact of specific housing and management conditions on stress physiology. FGM levels varied across zoo environments, although multiple confounding factors likely contributed to these differences. Additionally, social instability and aggression were linked to increased adrenocortical activity, as observed in an older female subjected to repeated attacks by a conspecific. In contrast reduced daily handling routines and a more stable social environment following the death of a dominant male were associated with lower FGM levels in another group. However, individual variability in stress responses highlights the importance of individualized monitoring for accurate welfare assessments. The second part of this thesis represents the first investigation into the presence of oxytocin in feces across any species. A protocol for extracting and quantifying oxytocin in lion feces was successfully developed and validated using enzyme immunoassay. Likewise, a methodology for extracting and quantifying fecal IgA in lions, was validated using enzyme immunoassay. Following these methodological advancements, we conducted an initial evaluation of the biological relevance of these biomarkers in captive lions under stable social and housing conditions. Results indicated that fecal IgA concentrations were influenced by sex, with females showing higher levels than males, whereas fecal oxytocin levels were not affected by biological factors. Finally, the relationship between oxytocin and IgA with the stress system was examined. While no strong or consistent correlation was found between fecal oxytocin and FGM concentrations, a positive relationship was observed between fecal IgA and FGM levels under basal conditions. However, this correlation was not consistently maintained across individuals when analyzing daily fluctuations in biomarker levels. Overall, this thesis contributes to a deeper understanding of stress physiology in lions under human care and represents a crucial first step in exploring fecal oxytocin and IgA as biomarkers of animal welfare. However, further research is needed to assess the relationship between these biomarkers and positive affect and to establish their reliability as physiological indicators in welfare assessments.