Biochemical and mechanical changes of the extracellular matrix during lung metastasis

Abstract

[eng] The mechanical properties of a tumor play an important role in cancer progression and therapeutic response. In fact, the stiffening of the tumor microenvironment has been linked to therapy resistance and an increased invasive behaviour. It is well-known that tumors are stiffer than their surrounding microenvironment, and recent data showing that the overexpression of certain ECM proteins, such as collagen and laminin is linked to worst prognosis and decreased therapeutic success of clinical patients, suggest an important role of the ECM on cancer development. However, the contribution of the mechanical properties of the cancer ECM during metastasis formation has not been studied in detail due to experimental limitations. In this doctoral thesis, we hypothesised that the mechanics of the ECM of lung metastases evolves during tumor growth and depends on the primary tumor site. Consequently, we set out to characterize biochemically and mechanically the ECM of lung metastases from different primary tumors and in response to anti-fibrotic treatment, specifically to nintedanib. To perform this study, we developed a novel decellularization procedure that efficiently produces acellular lung metastases sections while also preserving the tissue mechanics and the ECM’s biochemical components. The optimal decellularizing agent was determined by comparing reagents from six pre-existing decellularizing protocols with different methodologies in terms of ECM preservation, sample attachment and decellularization efficiency. This last parameter is customarily assessed by using DNA quantification kits, but we decided to develop a cheaper, quicker, and more practical alternative: an automated image-based algorithm in Python that can analyse dozens of images in minutes, as well as quantify other fluorescent images after immunostaining, thus also providing information on matrix preservation. With the combination of these two techniques, we were able to quantify the DNA remaining on the sample after decellularization, quantify ECM proteins before and after decellularization, and thus select sodium deoxycholate as the best option for ‘on-slide decellularization’. This protocol was applied to lung sections from mice injected with either mouse melanoma cells (B16F10) or Lewis lung Carcinoma cells (LLC1) that metastasized to the lungs. To measure ECM stiffness, we carried out force-indentation measurements using Atomic Force Microscopy (AFM) on

decellularized lung sections where tumors were identified. Decellularized metastases displayed distinct ECM structures that were similar in both models: a surrounding capsule, an interior dense ECM and a partially empty cavity where cancer cells used to be and where ECM was scarce. However, tumors from lung carcinoma (CAR) and melanoma (MEL) lung metastases showed different invasion phenotypes: CAR metastases infiltrated nearby tissues, forming tumor infiltration areas (TIA) while MEL metastases spread to different areas of the tumors, giving rise to micrometastases. Both these areas (TIA and micrometastases) represent the early stages of tumor invasion and showed a softening of the ECM (0.21±0.11kPa and 0.21±0.05kPa, for CAR and MEL, respectively), when compared to healthy lung ECM (0.42±0.09 kPa), as well as a depletion in collagen IV, collagen I and laminin, but a slight increase in fibronectin. The ECM from CAR macrometastases was more than 4x stiffer (1.79±1.32 kPa) than healthy lung ECM (0.42±0.09 kPa), while also showing a stark increase in fibronectin deposition (267.8±55.3% of the healthy lung ECM fibronectin) and a reduction of collagen I and IV and laminin. The ECM of MEL macrometastases on the other hand, showed a 17x fold increase in stiffness (6.39±3.40 kPa) when compared to healthy tissue, while also displaying a sharp increase in fibronectin (249.2±85.0% of the healthy lung ECM fibronectin), slightly increased levels of collagen I, and reduced collagen IV and laminin. In an attempt to soften the MEL ECM, we decided to administer the anti-fibrotic and anti-angiogenic drug, nintedanib. However, nintedanib surprisingly led to a significant increase in ECM deposition from 6.3±6.4% to 26.4±12.3% of the tumor area, and a doubling in tumor ECM stiffness from 6.39±3.40kPa to 12.35±5.74kPa, with and without nintedanib treatment, respectively. Since this increase in ECM deposition was strongly correlated with a sharp increase in tumor necrosis, it implies a connection between tumor vascularization (or lack thereof) and ECM production. Overall, the results described in this work suggest that the tumor ECM mechanics change throughout tumor development and can be an indicator of underlying tumorigenic mechanisms. Additionally, tumor ECM is heavily influenced by the primary site of the tumor, as evidenced by the different ECM structures, stiffness and composition of the melanoma and lung carcinoma metastases.

[spa] Las propiedades mecánicas del tumor desempeñan un papel importante en la progresión del cáncer y la respuesta terapéutica. De hecho, la rigidez del microambiente tumoral se ha relacionado con una mayor resistencia terapéutica y comportamiento invasivo. Es conocido que los tumores son más rígidos que su microambiente circundante y que datos recientes demuestran que la sobreexpresión de ciertas proteínas de la matriz extracelular (MEC), como el colágeno o la laminina, están relacionadas con un peor pronóstico y disminución del éxito terapéutico en pacientes; sugiriendo un rol esencial de la MEC en el desarrollo del cáncer. A pesar de ello, la contribución de las propiedades mecánicas de la MEC en cáncer durante la formación de la metástasis no ha sido estudiada en detalle, debido a las limitaciones experimentales que presenta. En esta tesis doctoral, se plantea la hipótesis de que la mecánica de la MEC en las metástasis pulmonares tiene una evolución durante el crecimiento del tumor y que depende de la localización del tumor primario. Por consiguiente, nos propusimos caracterizar bioquímica y mecánicamente la MEC de metástasis pulmonares de distintos tumores primarios y la respuesta al tratamiento antifibrótico con el fármaco nintedanib. Con el objetivo de llevar a cabo este estudio, desarrollamos un novedoso procedimiento de descelularización que produce eficientemente secciones de metástasis pulmonares acelulares, preservando, al mismo tiempo, la mecánica del tejido y los componentes bioquímicos de la MEC. El agente descelularizador óptimo se determinó comparando los reactivos de seis protocolos de descelularización preexistentes con diferentes metodologías de preservación de la MEC, fijación de la muestra y eficiencia de descelularización. Este último, se evalúa habitualmente mediante el uso de kits de cuantificación de ADN, sin embargo, decidimos desarrollar una alternativa más barata, rápida y práctica: un algoritmo totalmente automatizado basado en imágenes de Python con capacidad para analizar docenas de imágenes en minutos, así como cuantificar imágenes fluorescentes tras la inmunotinción, proporcionando así información sobre la conservación de la matriz. Con la combinación de estas dos técnicas, fuimos capaces de cuantificar el ADN presente en la muestra tras el proceso de descelularización, cuantificar proteínas de la MEC antes y después de la descelularización y también, seleccionar el desoxicolato de sodio como la mejor opción para realizar el protocolo

de descelularización sobre un portaobjetos de vidrio mientras las muestras están firmemente adheridas a este. Este protocolo se aplicó a secciones de tejido pulmonar de ratones inyectados con células de ratón (B16F10) o células de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC1) que formaron metástasis en los pulmones. La rigidez de la MEC fue analizada mediante medidas de fuerza-indentación por Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) en secciones pulmonares descelularizadas donde se identificaron los tumores. Las metástasis descelularizadas mostraron estructuras de la MEC diferenciales que fueron compartidas en ambos modelos: una cápsula circundante, una MEC interior densa y una cavidad mayoritariamente vacía donde se encontraban las células cancerosas y la MEC era escasa. Sin embargo, los tumores de metástasis pulmonares de carcinoma (CAR) y melanoma (MEL) mostraron fenotipos de invasión diferentes: las metástasis de CAR se infiltraron en tejidos cercanos, formando áreas de infiltración tumoral, mientras que las metástasis de MEL se extendieron a diferentes zonas de los tumores, dando lugar a micrometástasis. Ambas zonas representan las primeras etapas de la invasión tumoral y mostraron un reblandecimiento de la MEC (0,21±0,11kPa y 0,21±0,05kPa, para CAR y MEL respectivamente) en comparación con la MEC de pulmón sano (0,42±0,09 kPa), así como una disminución del colágeno IV, colágeno I y laminina, pero un ligero aumento de la fibronectina. La MEC de las macrometástasis de CAR fueron 4 veces más rígida (1,79±1,32 kPa) que la MEC del pulmón sano (0,42±0,09 kPa), al mismo tiempo que mostraba un marcado aumento de la deposición de fibronectina (267,8±55,3% de la fibronectina de la MEC del pulmón sano) así como, una reducción de los niveles de colágeno I y IV y de laminina. Por otro lado, la MEC de las macrometástasis de MEL, mostró un aumento de la rigidez 17 veces mayor (6,39±3,40 kPa) en comparación con el tejido sano, al mismo tiempo que mostraba un fuerte aumento de la fibronectina (249,2±85,0% de la fibronectina de la MEC del pulmón sano), un ligero aumento de los niveles de colágeno I y una reducción de los niveles de colágeno IV y la laminina. En un intento de suavizar la MEC de MEL, decidimos administrar el fármaco antifibrótico y antiangiogénico nintedanib. Sin embargo, éste sorprendió al provocar un aumento significativo de la deposición de ECM del 6,3±6,4% al 26,4±12,3% del área del tumor, y una duplicación de la rigidez de la ECM del tumor de 6,39±3,40kPa a 12,35±5,74kPa, sin y con tratamiento, respectivamente. Dado que este aumento de la deposición de MEC estaba fuertemente correlacionado con un fuerte aumento de la necrosis tumoral, implica una conexión entre la vascularización del tumor (o la falta

de ella) y la producción de MEC. Por lo tanto, concluimos que los resultados descritos en este trabajo sugieren que la mecánica de la MEC tumoral cambia a lo largo del desarrollo del tumor y puede ser un indicador de mecanismos tumorigénicos subyacentes.