Novel molecular insights into the cholinergic C-type synapse: implications in healthy and diseased motor neurons

Abstract

Les motoneurones (MNs) reben sinapsis excitadores i inhibidores que regulen la seva activitat i, en última instància, el comportament motor. Entre aquestes, les sinapsis colinèrgiques de tipus C (botons C) destaquen com un dels aferents excitadors més grans, i presenten una organització postsinàptica única, que inclou una cisterna subsinàptica (SSC) i un conjunt de proteïnes, com el receptor colinèrgic muscarínic M2, el canal Kv2.1, la neuregulina-1 i el receptor sigma-1 (S1R). Aquesta maquinària molecular permet als botons C modular l’excitabilitat de les MNs en funció de la demanda motora. L’excitabilitat de les MNs sembla influir en la seva vulnerabilitat, i les alteracions dels botons C han emergit com a possibles contribuents a malalties de la MN. Tanmateix, el paper dels diferents components del botó C en la fisiologia i patologia de les MNs encara és poc conegut.

L’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat aprofundir en el coneixement de la rellevància fisiològica i patològica de diferents components moleculars del botó C. Per a això, hem caracteritzat un nou component molecular d’aquestes sinapsis i hem investigat el paper del S1R en l’organització del botó C. A més, hem analitzat les alteracions d’aquestes sinapsis en l’atròfia muscular espinal (AME) i explorat la seva modulació mitjançant el nusinersen, una estratègia terapèutica dirigida al gen causant de la malaltia.

Per a aquests estudis, s’han emprat ratolins salvatges, ratolins knockout per a S1R (S1R-KO) i el model murí d’AME severa SMN∆7, entre d'altres, així com estratègies de microscòpia confocal i electrònica, complementades amb procediments moleculars i bioquímics.

Els nostres resultats han revelat que l’anticòs monoclonal Y172, dirigit contra el factor de transcripció fosfo (p)-c-Jun (serina [Ser]63), immunotenyeix un nou component molecular no identificat dels botons C, anomenat Y172-related protein. Aquest s’ha localitzat en la SSC de la regió postsinàptica del botó C, mostrant una estreta associació amb S1R. En ratolins S1R-KO, l’absència de S1R ha impedit l’agrupació de la Y172-related protein en les seves localitzacions específiques, induit una dilatació de l'SSC i augmentat els processos autofàgics en la regió postsinàptica dels botons C. No obstant això, la seva absència només ha afectat modestament l’agrupació d’altres molècules dels botons C i no ha alterat altres tipus sinàptics. El model SMN∆7 ha mostrat una reducció en la densitat dels components pre- i postsinàptics dels botons C en les etapes avançades de la malaltia, probablement a causa d’una degeneració sinàptica secundària a la patologia intrínseca de les MNs. Aquestes alteracions han estat parcialment previngudes pel tractament amb nusinersen.

En conclusió, aquest treball identifica la Y172-related protein com un nou component dels botons C i proporciona nous coneixements sobre el paper d’S1R en aquesta sinapsi. Els nostres resultats estableixen les bases per a futures investigacions dirigides a determinar la identitat molecular de la Y172-related protein i aclarir la seva relació amb S1R en la regulació de l’excitabilitat de les MNs. A més, indiquen que les alteracions en les proteïnes del botó C podrien contribuir secundàriament a la degeneració de les MNs i no s’haurien de desestimar com a possibles dianes terapèutiques complementàries per a les malalties de la MN.

Las motoneuronas (MNs) reciben sinapsis excitatorias e inhibitorias que regulan su actividad y, en última instancia, el comportamiento motor. Entre ellas, las sinapsis colinérgicas de tipo C (botones C) destacan como uno de los aferentes excitatorios más grandes y presentan una organización postsináptica única, que incluye una cisterna subsináptica (SSC) y un conjunto de proteínas, como el receptor colinérgico muscarínico M2, el canal Kv2.1, la neuregulina-1 y el receptor sigma-1 (S1R). Esta maquinaria permite a los botones C modular la excitabilidad de las MNs en función de la demanda motora. La excitabilidad de las MNs influye en su vulnerabilidad, y las alteraciones en los botones C han emergido como posibles contribuyentes a enfermedades de la MN. Sin embargo, el papel de los distintos componentes del botón C en la fisiología y patología de las MNs sigue siendo poco comprendido.

El objetivo principal de esta tesis ha sido profundizar en el conocimiento de la relevancia fisiológica y patológica de distintos componentes moleculares del botón C. Para ello, hemos caracterizado un nuevo componente molecular de estas sinapsis e investigado el papel del S1R en la organización del botón C. Además, hemos analizado las alteraciones de estas sinapsis en la atrofia muscular espinal (AME) y explorado su modulación mediante nusinersen, una estrategia terapéutica dirigida al gen causante de la enfermedad.

Para estos estudios, se han empleado ratones silvestres, ratones knockout para S1R (S1R-KO) y el modelo murino de AME severa SMN∆7, entre otros; y estrategias de microscopía confocal y electrónica, complementadas con procedimientos moleculares y bioquímicos. Nuestros hallazgos han revelado que el anticuerpo monoclonal Y172, dirigido contra el factor de transcripción fosfo (p)-c-Jun (serina [Ser]63), inmunotiñe un nuevo componente molecular no identificado de los botones C, denominado Y172-related protein. Éste se ha localizado en la SSC de la región postsináptica del botón C, estrechamente asociado con S1R. En ratones S1R-KO, la ausencia de S1R ha impedido la agrupación de la Y172-related protein en sus localizaciones específicas, inducido una dilatación de la SSC y aumentado los procesos autofágicos en la región postsináptica de los botones C. No obstante, su ausencia solo ha afectado modestamente a la agrupación de otras moléculas de los botones C y no ha alterado otros tipos sinápticos. El modelo SMN∆7 ha mostrado una reducción en la densidad de los componentes pre- y postsinápticos de los botones C en las etapas avanzadas de la enfermedad, probablemente debido a una degeneración sináptica secundaria a la patología intrínseca de las MNs. Estas alteraciones han sido parcialmente prevenidas por el tratamiento con nusinersen.

En conclusión, este trabajo identifica a la Y172-related protein como un nuevo componente de los botones C y proporciona nuevos conocimientos sobre el papel de S1R en esta sinapsis. Nuestros hallazgos sientan las bases para futuras investigaciones dirigidas a determinar la identidad de la Y172-related protein y esclarecer su relación con S1R en la regulación de la excitabilidad de las MNs. Además, indican que las alteraciones en las proteínas del botón C podrían contribuir secundariamente a la degeneración de las MNs y no deben desestimarse como posibles dianas terapéuticas complementarias para las enfermedades de la MN.

Motor neurons (MNs) are innervated by a variety of excitatory and inhibitory synapses that control their activity and, ultimately, motor behavior. One of the largest excitatory inputs on MNs are cholinergic C-type synapses (C-boutons). These exhibit unique features in their postsynaptic counterpart, including a structure termed subsurface cistern (SSC) and a constellation of proteins such as the M2 muscarinic acetylcholine receptor, the Kv2.1 channel, neuregulin-1, and the sigma-1 receptor (S1R). This molecular machinery allows C-boutons to provide a task-dependent fine-tuning of MN excitability. Evidence indicates that MN excitability is a key determinant of MN vulnerability, and alterations in C-boutons are gaining relevance as potential contributors to MN diseases. However, the precise functions of C-bouton components and their impact on MN health and disease remain poorly understood.

This thesis aimed to gain new insights into the physiological and pathological significance of distinct molecular components of the C-bouton machinery. For this, we characterized a novel molecular component of these synapses and investigated the role of S1R in C-bouton organization. Additionally, we analyzed C-bouton alterations in spinal muscular atrophy (SMA), the most common genetic MN disease in childhood, and explored their modulation by nusinersen, a therapeutic strategy targeting the disease-causing gene.

To achieve this, wild-type mice, S1R knockout (S1R-KO) mice, and the SMN∆7 mouse model of severe SMA, among other in vivo and in vitro models, were analyzed using confocal and electron microscopy, complemented by molecular and biochemical procedures.

Our findings revealed that the monoclonal Y172 antibody against the transcription factor phospho(p)-c-Jun (serine [Ser]63) selectively immunostains a novel, unidentified molecular component of C-boutons, termed Y172-related protein. This protein is specifically localized at the SSC of the C-bouton postsynaptic counterpart and is closely associated with S1R. In S1R-KO mice, S1R deficiency impeded the formation of Y172-related protein clusters, induced SSC swelling, and enhanced autophagic-like processes within the postsynaptic counterpart of C-boutons. However, the absence of this protein had only modest effects on the clustering of other C-bouton molecules and did not impact other types of synapses contacting MNs. In the SMN∆7 mouse model, a reduced density of C-bouton pre- and postsynaptic components was observed at late disease stages, likely due to synaptic degeneration secondary to intrinsic MN pathology. These alterations were partially prevented by nusinersen treatment.

In conclusion, this work establishes the Y172-related protein as a novel component of C-boutons and provides new insights into the role of S1R at this synapse. Our findings lay a foundation for future investigations aiming to elucidate the molecular identity of the Y172-related protein and further clarify its relationship with S1R in the regulation of MN excitability. Furthermore, they underscore alterations in C-bouton-associated proteins as secondary contributors to MN degeneration that should not be overlooked as potential complementary therapeutic targets for MN diseases.