Impact of culture media composition and folate availability on nucleotide metabolism in human cells: Insights into Lesch-Nyhan Disease

Abstract

Els nucleòtids són el principal repositori d'informació genètica (ADN i ARN), però també són molècules essencials per a funcions estructurals, energètiques i de senyalització cel·lular. Tant les purines com les pirimidines són necessàries per a la supervivència i proliferació cel·lular. Hi ha dues vies de síntesi de purines en cèl·lules eucariotes: la via de novo, que requereix una gran quantitat d’energia, i la via de reutilització, que és menys costosa energèticament i està regulada per les enzims HPRT i APRT. L’àcid fòlic (AF) és un cofactor essencial per a la síntesi de novo de purines. Tanmateix, els medis de cultiu comercials tradicionalment contenen nivells elevats i no fisiològics d’AF (2200 nM o més), cosa que no reflecteix amb precisió la situació in vivo. Curiosament, el medi de cultiu RPMI amb concentracions fisiològiques d’AF (25 nM) produeix una acumulació de ZMP, un nucleòtid intermediari en la via de biosíntesi de novo de purines, en diverses línies cel·lulars. La major expressió del transportador SLC19A1 en una línia cel·lular es correlaciona amb la l’acumulació de ZMP a nivells fisiològics d’AF, o amb el contingut total de purines a nivells alts d’AF, indicant una major dependència de la via de síntesis de novo de purines. També hem investigat com el cultiu de línies cel·lulars humanes en un nou medi formulat per simular els nivells fisiològics de nutrients (Plasmax-PV) afecta la síntesi de nucleòtids i la mort cel·lular induïda per metotrexat (MTX). En Plasmax-PV, la majoria de les línies cel·lulars no van mostrar alteracions en els nucleòtids; en canvi, les cèl·lules Jurkat van presentar acumulació de ZMP i dUMP, suggerint una alteració en la síntesi de purines i pirimidienes. Cal ressaltar que la deficiència en HPRT confereix una major sensibilitat al tractament amb MTX. La suplementació de Plasmax-PV amb alts nivells d’AF reverteix aquestes alteracions. És destacable que una dosi molt baixa de MTX indueix apoptosi en cèl·lules Jurkat cultivades amb Plasmax-PV de manera més marcada que quan es cultiven amb RPMI estàndard. Suplements de timidina prevenen totalment l’apoptosi induïda per MTX, confirmant una alteració en la síntesi de pirimidines en els limfòcits humans. La via de síntesi de novo de purines implica una sèrie d’enzims que s’agrupen en un complex multienzimàtic anomenat purinosoma. L’estudi d’aquesta estructura en cèl·lules tumorals i derivades de pacients va revelar que la formació del purinosoma es correlaciona amb una dependència més gran de la síntesi de novo de purines, ja sigui deguda a la deficiència d’enzims de reutilització (com HPRT) o a la disponibilitat limitada de purines al medi. Les alteracions a les vies de síntesi de nucleòtids estan implicades en malalties metabòliques com la malaltia de Lesch-Nyhan (LND), un trastorn neurològic rar causat per la deficiència de l’enzim HPRT, implicat en la via de reutilització de les purines. Fibroblasts derivats de pacients amb LND van presentar acumulació de ZMP i nivells elevats d’expressió del transportador SLC19A1, canvis només observables quan les cèl·lules es van cultivar en Plasmax-PV. En resum, els nostres resultats destaquen l’impacte de la composició dels medis de cultiu en estudis in vitro. Mitjançant l’ús de medis fisiològics hem descobert alteracions de nucleòtids en cèl·lules humanes, que estan emmascarades per les formulacions convencionals, i que podria millorar la rellevància translacional dels models experimentals. Per exemple, poden ajudar a optimitzar la dosi de MTX per al tractament de la leucèmia o de l’artritis reumatoide, o en la comprensió de la fisiopatologia de la malaltia de Lesch-Nyhan.

Los nucleótidos son el principal repositorio de la información genética (ADN y ARN), pero también son moléculas esenciales para funciones estructurales, energéticas y de señalización celular. Tanto las purinas como las pirimidinas son necesarias para la supervivencia y proliferación celular. Hay dos vías de síntesis de purinas en células eucariotas: la vía de novo, que requiere una gran cantidad de energía, y la de reutilización, que es menos costosa energéticamente y está regulada por las enzimas HPRT y APRT. El ácido fólico (AF) es un cofactor esencial para la síntesis de novo de purinas. Sin embargo, los medios de cultivo comerciales tradicionalmente contienen niveles elevados y no fisiológicos de AF (2200 nM o más), lo cual no refleja con precisión la situación in vivo. Curiosamente, el medio de cultivo RPMI con concentraciones fisiológicas de AF (25 nM) produce una acumulación de ZMP, un nucleótido intermediario en la vía de biosíntesis de novo de purinas, en varias líneas celulares. La mayor expresión del transportador SLC19A1 en una línea celular se correlaciona con la acumulación de ZMP a niveles fisiológicos de AF, o con el contenido total de purinas a niveles altos de AF, indicando una mayor dependencia de la vía de síntesis de novo de purinas. También hemos investigado cómo el cultivo de líneas celulares humanas en un nuevo medio formulado para simular los niveles fisiológicos de nutrientes (Plasmax-PV) afecta a la síntesis de nucleótidos y la muerte celular inducida por metotrexato (MTX). En Plasmax-PV, la mayoría de las líneas celulares no mostraron alteraciones en los nucleótidos, en cambio, las células Jurkat presentaron acumulación de ZMP y dUMP, sugiriendo una alteración en la síntesis de purinas y pirimidinas. Cabe resaltar que la deficiencia en HPRT confiere una mayor sensibilidad al tratamiento con MTX. La suplementación de Plasmax-PV con altos niveles de AF revierte estas alteraciones. Es destacable que una dosis muy baja de MTX induce apoptosis en las células Jurkat cultivadas con Plasmax-PV de forma más marcada que cuando son cultivadas con RPMI estándar. Suplementos de timidina previenen totalmente la apoptosis inducida por MTX, confirmando una alteración en la síntesis de pirimidinas en los linfocitos humanos. La vía de síntesis de novo de purinas implica a una serie de enzimas, que se agrupan en un complejo multienzimático llamado purinosoma. El estudio de esta estructura en células tumorales y derivadas de pacientes reveló que la formación del purinosoma se correlaciona con una mayor dependencia en la síntesis de novo de purinas, ya sea debido a la deficiencia de enzimas de reutilización (como HPRT) o a la disponibilidad limitada de purinas en el medio. Las alteraciones en las vías de síntesis de nucleótidos están implicadas en enfermedades metabólicas como la enfermedad de Lesch-Nyhan (LND), un desorden neurológico raro causado por la deficiencia de la enzima HPRT, implicada en la vía de reutilización de las purinas. Fibroblastos derivados de pacientes con LND presentaron acumulación de ZMP y elevados niveles de expresión del transportador SLC19A1, cambios solo observables cuando las células se cultivaron en Plasmax-PV. En resumen, nuestros resultados destacan el impacto de la composición de los medios de cultivo en estudios in vitro. Mediante el uso de medios fisiológicos hemos descubierto alteraciones de nucleótidos en células humanas, que están enmascaradas por las formulaciones convencionales, que podrían mejorar la relevancia traslacional de los modelos experimentales. Por ejemplo, pueden ayudar en la optimización de la dosis de MTX para el tratamiento de la leucemia o la artritis reumatoide, o en la comprensión de la fisiopatología de la enfermedad de Lesch-Nyhan.

Nucleotides are the primary repositories of genetic information (DNA and RNA), but they are also essential molecules for structural, energetic and cell signaling processes. Both purines and pyrimidines are needed for cell survival and proliferation. There are two different pathways for the synthesis of purines in eukaryotic cells: the de novo pathway, whose energy demand is high, and the salvage pathway, energetically cheaper and regulated by the HPRT and APRT enzymes. Folic acid (FA) is an essential cofactor for the de novo purine synthesis. However, commercial cell culture media traditionally contain non-physiological high levels of FA (2200 nM or more), which do not accurately reflect the in vivo situation. Interestingly, RPMI culture medium containing physiological concentration of FA (25 nM) produces differential accumulation of ZMP, an intermediate nucleotide in the de novo purine biosynthetic pathway, in several human cell lines. Expression of the folate carrier SLC19A1 in a cell line is correlated with ZMP accumulation at physiological levels of FA, or with total purine nucleotide content at high levels of FA. We also investigated how culturing human cell lines in a new medium formulated to mimic physiological levels of all nutrients (Plasmax-PV) affects nucleotide synthesis and cell death induced by methotrexate (MTX). In Plasmax-PV, most of the cell lines do not show any nucleotide alteration, but Jurkat cells show accumulation of ZMP and dUMP, suggesting a disruption of both purine and pyrimidine biosynthetic pathways. It is noteworthy that HPRT-deficiency confers an increased sensitivity to MTX treatment. Indeed, supplementing Plasmax-PV with high levels of FA reverse these alterations. Importantly, a low dose of MTX induces apoptosis of Jurkat cells cultured in Plasmax-PV in a more remarkable way than in standard RPMI medium. Thymidine supplementation completely blocked MTX-induced apoptosis, confirming an impairment of pyrimidine biosynthesis in human lymphocytes. The de novo purine synthesis involves a set of enzymes that assemble into a multienzyme complex known as purinosome. Studies of this structure in tumor and patient-derived cells revealed that purinosome formation correlates with increased reliance on the de novo pathway, either due to salvage pathway deficiency (HPRT loss) or limited availability of extracellular purines. Alterations in nucleotide synthesis pathways are implicated in metabolic diseases such as Lesch-Nyhan disease (LND), a rare neurological disorder caused by the deficiency of HPRT, an enzyme involved in the purine salvage pathway. Fibroblasts derived from LND patients exhibited increased accumulation of ZMP and higher expression of the folate transporter SLC19A1. Notably, these changes were only detected in cells cultured in Plamax-PV. In summary, our findings highlight the critical impact of the culture medium composition on in vitro studies. By using physiological media, we revealed nucleotide alterations in human cells, masked by conventional formulations, that may improve the translational relevance of experimental models. For instance, they can help in MTX-dose optimization for the treatment of leukemia and rheumatoid arthritis as well as understanding the physiopathology of Lesch-Nyhan disease.