Capture and identification of carbohydrate-binding proteins by SPR and CREDEX-MS

Author

Jiménez-Castells, Carmen

Director

Gutiérrez Gallego, Ricardo

Andreu Martínez, David

Date of defense

2010-12-20

ISBN

978-84-694-3915-9

Legal Deposit

B.13213-2011



Department/Institute

Universitat Pompeu Fabra. Departament de Ciències Experimentals i de la Salut

Doctorate programs

Programa de doctorat en Biomedicina

Abstract

Carbohydrate-binding proteins of non-immunological origin -lectins- have been recognized over the last decades as decisive players in numerous biological processes, ranging from cellcell communication, fertilization, pathogen-cell adhesion to metastasis. Consequently, there is an increasing interest in finding powerful and nanosized tools to screen for these molecules and to study their carbohydrate interactions in detail. Here, two complementary approaches are described to characterize lectin-carbohydrate interactions with high sensitivity, low sample consumption, and without the need for sample labelling: SPR and CREDEX-MS. In SPR, we have developed an approach where the sugar is immobilized onto a sensor surface through a tailor-made peptide module that allows (1) to capture the lectin, (2) to characterize the interaction through kinetic and thermodynamic parameters, and (3) to identify the interacted protein by mass spectrometry. In CREDEX-MS, based on proteolytic excision of proteincarbohydrate complexes and mass spectrometric analysis, the peptides comforming the carbohydrate binding domain are identified.


Las lectinas (proteínas de origen no inmune capaces de reconocer azúcares) se han revelado en las últimas décadas como participantes cruciales en multitud de procesos biológicos, tales como la comunicación célula-célula, la fertilización, la adhesión del patógeno a la célula y la metástasis, entre muchos otros. Por lo tanto, existe un gran interés en el desarrollo de técnicas analíticas potentes para el estudio de las interacciones lectina-carbohidrato. En este trabajo, se describen dos aproximaciones complementarias mediante las cuales se pueden caracterizar las interacciones lectinas-azúcar con gran sensibilidad, poca utilización de muestra y sin la necesitad de ningún marcaje. En la técnica basada en resonancia de plasmón superficial (SPR), el azúcar es inmovilizado sobre una superficie a través de un módulo peptídico, lo cual permite (1) capturar la lectina, (2) caracterizar su interacción mediante parámetros cinéticos y termodinámicos y (3) identificar posteriormente la proteína mediante espectrometría de masas. Complementariamente, la técnica CREDEX-MS, basada en la excisión proteolítica del complejo proteína-azúcar y posterior análisis por espectrometría de masas, nos permite identificar los péptidos que forman parte del dominio de unión al azúcar.

Keywords

glycopeptide probe; Erythrina cristagalli agglutinin; concanavalin A; chemoselective ligation; carbohydrates; carbohydrate-lectin interactions; aminooxyacetic acid; tripsina; SPR-MS; sonda glicopeptídica; síntesis en fase sólida; resonancia de plasmón superficial; proteólisis limitada; oxima; oligosacáridos; N-acetyl-lactosamina; monosacáridos; MALDI-TOF; lectinas vegetales; lectina de Erythrina cristagalli; interacción lectina-carbohidrato; espectrometría de masas; conjugación selectiva; concanavalina A; carbohidrato; ácido siálico; ácido aminooxiacético; limited proteolysis; mass spectrometry; monosaccharides; N-acetyl-lactosamine; oligosaccharides; oxime; plant lectins; sialic acid; Solid Phase Peptide Synthesis; SPR-MS; Surface Plasmon Resonance; trypsin

Subjects

577 - Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics

Documents

tcjc.pdf

4.838Mb

 

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