Modelització de l'endometri en cultius en tres dimensions: estudis de morfogènesi i oncogènesi endometrial

Abstract

L’endometri és el revestiment interior de la mucosa de l’úter. Histològicament, en l’endometri podem diferenciar dos tipus cel·lulars epitelials: l’epiteli luminal i l’epiteli glandular. Els teixits epitelials es caracteritzen per ser teixits polaritzats que presenten unes característiques morfològiques distingibles com són: polarització apico-basal, contactes cèl·lula - cèl·lula específics i adhesió a la membrana Basal. El primer objectiu d’aquest treball va ser la creació d’un cultiu en tres dimensions (3D) de cèl·lules epitelials d’endometri de ratolí, que permetés la possibilitat d’estudiar els diferents processos relacionats amb la morfogènesi i carcinogènesi endometrial. Un cop desenvolupat el sistema de cultiu, vam estudiar els factors extracel·lulars que influïen en la correcta formació del lumen glandular, així com l’establiment de la polaritat de les cèl·lules epitelials que formen les glàndules. D’aquesta manera hem pogut determinar un nou paper de les citocines TNF-α i IL-1α en la formació i manteniment del lumen. A més a més, també hem pogut demostrar que els glucocorticoides són els encarregats de reprimir l’expressió d’aquestes citocines a través de l’acció del receptor d’estrògens. En segon lloc, hem utilitzat el model de cultiu desenvolupat per estudiar aspectes relacionats amb la polaritat cel·lular i la carcinogènesi. Recentment s’ha suggerit que l’establiment de la polarització cel·lular podria actuar com a supressor tumoral mentre que la pèrdua de la mateixa, és un reconegut marcador de la progressió tumoral. Per aquest motiu, i utilitzant el nostre sistema de cultiu, vam voler caracteritzar l’acció del TGF-β tant en cèl·lules polaritzades com en no polaritzades. En aquest treball demostrem que la pèrdua de la polaritat canvia la resposta pro-apoptòtica del TGF-β en cèl·lules polaritzades a una resposta associada a la progressió del fenotip tumoral (EMT) en cèl·lules no polaritzades. Finalment vam voler estudiar els efectes de l’hiperestrogenisme en relació a pèrdues del gen supressor de tumors PTEN en la carcinogènesi endometrial. Per una banda, les pèrdues del supressor tumoral PTEN constitueixen una de les principals alteracions en el carcinoma d’endometri. Per altra banda, l’hiperestrogenisme és un conegut factor de risc en el desenvolupament de neoplasies endometrials. Tanmateix, no està clara si l’acció de l’estradiol sobre les cèl·lules epitelials, és directa o és dóna a través d’un efecte paracrí de les cèl·lules del estroma; i si la pèrdua d’expressió de PTEN té repercussió en els efectes produïts pels estrògens sobre l’endometri. Per aquest motiu, vam voler investigar els efectes de l’estradiol en cèl·lules polaritzades que creixen en un medi definit, sense la interferència de factors paracrins provinents de les cèl·lules de l’estroma. Els nostres estudis indiquen que l’estradiol i la Insulina cooperen en la regulació de la proliferació de cèl·lules endometrials a través del receptor d’estrògens α. A més a més, pèrdues al·lèliques en PTEN donen lloc a una proliferació desmesurada en resposta a Insulina i estradiol, similar a la que es troba en les hiperplàsies endometrials. Fa més d’una dècada que es va suggerir, per primera vegada, la rellevància de la polarització cel·lular a l’hora d’entendre els mecanismes involucrats en la morfogènesi cel·lular així com en la progressió tumoral. Tot i això, avui en dia encara es desconeixen molts dels mecanismes involucrats en aquest processos. En aquest context, el nostre treball és important perquè: per primer cop, hem generat un cultiu en 3D de cèl·lules no immortalitzades i no transformades; hem determinat quins són els factors extracel·lulars involucrats en el manteniment i formació de la cavitat luminal; hem aportat evidencies què la polaritat epitelial actua com a supressor tumoral no canònic i; hem demostrat que pèrdues en PTEN causen una hiperplàsia de les cèl·lules endometrials en resposta a l’exposició a l’estradiol i la Insulina.

El endometrio es el revestimiento interior de la mucosa del útero. Histológicamente en el endometrio podemos diferenciar dos tipos celulares epiteliales: el epitelio luminal y el glandular. Los tejidos epiteliales se caracterizan por ser tejidos polarizados que presentan unas características morfológicas distinguibles como son: polarización apico-Basal, contactos célula - célula específicos y adhesión a la membrana Basal. El primer objetivo de este trabajo fue la creación de un cultivo en tres dimensiones (3D) de células epiteliales de endometrio de ratón, que presentara algunas ventajas a los cultivos ya existentes, a la vez que permitiera la posibilidad de estudiar los diferentes procesos relacionados con la morfogénesis y la carcinogénesis endometrial. Una vez obtenido el sistema de cultivo, quisimos estudiar los factores extracelulares que influían en la correcta formación del lumen de las glándulas, así como el establecimiento de la polaridad de las células epiteliales que forman las glándulas. De esta manera hemos podido determinar un nuevo papel de las citoquinas TNF-α y IL-1α en la formación y mantenimiento del lumen. Además, también hemos podido concluir que los glucocorticoides son los encargados de reprimir la expresión de estas citoquinas a través de la acción del receptor de estrógenos. En segundo lugar, utilizamos el modelo de cultivo desarrollado, para estudiar aspectos relacionados con la polaridad celular y la carcinogénesis. Recientemente se ha sugerido que el establecimiento de la polarización celular podría actuar por si misma como un supresor tumoral, mientras que la pérdida de dicha polarización es un reconocido marcador de la progresión tumoral. Por este motivo, y utilizando nuestro sistema de cultivo, quisimos caracterizar la acción del TGF-β tanto en células polarizadas como en no polarizadas. En este trabajo demostramos que la pérdida de la polaridad, cambia la respuesta pro-apoptótica del TGF-β en células polarizadas a una respuesta asociada a la progresión del fenotipo tumoral (EMT) en células no polarizadas. Finalmente quisimos estudiar los efectos del hiperestrogenismo en la tumorogénesi endometrial. El hiperestrogenismo es un factor de riesgo muy importante en el desarrollo de neoplasias endometriales. Sin embargo, no está claro si la acción del estradiol es directa o se da mediante un efecto paracrino de las células del estroma. Por este motivo, quisimos investigar los efectos del estradiol en células polarizadas que crecían en un medio definido, sin la interferencia de factores paracrinos procedentes de las células del estroma. Gracias a nuestro estudio, hemos podido determinar que la acción del estradiol mediante el receptor de estrógenos alpha, actúa por debajo de la acción de PTEN en la tumorogénesis endometrial. Hace más de una década se sugirió, por primera vez, la relevancia de la polarización celular a la hora de entender los mecanismos involucrados en la morfogénesis celular así como la progresión tumoral. Sin embargo, hoy en día todavía se desconocen muchos de los mecanismos involucrados en estos procesos. En este contexto, nuestro trabajo es importante porque: por primera vez hemos generado un cultivo en 3D de células no transformadas, hemos determinado cuáles son los factores extracelulares involucrados en el mantenimiento y formación de la cavidad luminar, hemos aportado evidencias de que la polaridad epitelial actúa como supresor tumoral no canónico y que el hiperestrogenismo ligado a una deficiencia en la expresión de PTEN da lugar a un fenotipo de hiperplasia.

The endometrium is innermost glandular layer of the uterus. It functions as a lining for the uterus. Histologically, we can distinguish two types of epithelial cells: luminal and glandular epithelium. The epithelial tissues have some distinct morphological features such as: apico-Basal polarity, cell-cell specific contacts and adhesion to the basement membrane. The first objective of this work was to establish a three dimensional culture (3D) of mouse endometrial epithelial cells suitable for the study of endometrial morphogenesis and carcinogenesis. Once the 3D culture protocol was established, our next step was to analyze the influence of the extracellular factors in the formation and maintenance of the glandular lumen. To this regard, we have identified a new role of cytokines TNF-α and IL-1α in the formation and maintenance of the lumen. In addition, we demonstrate that glucocorticoids are the responsible of cytokine down-expression, in an estrogen receptor alpha dependent manner. Our next step was to use our culture model to study the issues related with the cellular polarity and malignance development. Recently it has been suggested that the establishment of cell polarization is a potent tumor suppressor mechanism. Loss of this polarization is a wellknown marker of tumor progression. Taking advantage of our 3D culture system, we sought to characterize the action of TGF-β in both polarized cells and in non-polarized. In this study, we show that loss of polarity changes the pro-apoptotic response of TGF-β (in polarized cells) to a response associated with tumor progression phenotype (EMT) in non-polarized cells. Finally we wanted to study the effects of hyperestrogenism. Hyperestrogenism represent a major risk for development of endometrial neoplasia. However, it is unclear whether estradiol action occurs direct or trough a paracrine effect of stromal cells. For this reason, we wanted to investigate the effects of estradiol on polarized cells growing in a defined medium without interference of paracrine stromal factors. With our study, we could conclude that estradiol trough its receptor, acts as downstream mediator on PTEN mediated tumorogenesis. More than one decade ago, cell polarization was as an important mechanisms involved in cellular morphogenesis and tumor progression. However, most of the mechanisms involved in these processes are still unknown. Our study provides new insights about mechanisms involved in those processes. In this context, we have generated, for the first time, a 3D culture from untransformed cells, we have determined the extracellular factors involved in maintaining and formation of the luminal cavity, we have provided evidence that epithelial polarity acts as a non-canonical tumor suppressor and PTEN deficient expression leads an exacerbated response to estrogen, which leads to loss of cell polarity and glands structure, two alterations observed in cancer.