Infection studies with chamois border disease virus in pyrenean chamois, sheep and pig

Abstract

Las poblaciones de rebeco pirenaico (Rupicapra pyrenaica) situadas en el Pirineo central y oriental se han reducido drásticamente debido a sucesivos brotes de enfermedad asociados a un Virus de la Enfermedad de la Frontera (BDV en sus siglas en inglés) desde el año 2001. Sin embargo, la enfermedad observada no presenta las características clásicas de la Enfermedad de la Frontera, descrita en las especies domésticas. La presente investigación tiene como objetivo investigar la patogenia de la enfermedad asociada al BDV del rebeco (ch-BDV) en rebecos infectados de manera natural y en tres especies infectadas experimentalmente: rebeco pirenaico, oveja y cerdo. En primer lugar, investigamos la excreción, distribución y cuantificación del ch-BDV en los órganos de rebecos infectados de manera natural. El suero y los tejidos analizados fueron positivos mediante RT-PCR y aislamiento vírico en todos los animales estudiados. Los hisopos nasal, oral y rectal, así como la orina fueron también positivos mediante RT-PCR en casi todas las muestras analizadas, confirmando que el virus se elimina al ambiente a través de las vías de excreción analizadas. El estudio serológico no detectó anticuerpos en ningún rebeco utilizando técnicas de ELISA y seroneutralización. El estudio genético de la región no codificante 5’ confirmó que el virus pertenecía al grupo BDV-4, tal y como se había descrito anteriormente en los brotes de enfermedad. La presencia de un feto positivo al ch-BDV mediante RT-PCR sugiere que sea posible la existencia de animales persistentemente infectados. El objetivo de la infección experimental en el rebeco pirenaico fue la reproducción en condiciones experimentales de la enfermedad observada en los rebecos salvajes. Siete rebecos (cinco seronegativos y dos seropositivos a anticuerpos frente a BDV) fueron inoculados con una cepa BDV aislada de un rebeco de campo infectado. Tres animales más se mantuvieron como controles. Los cinco rebecos seronegativos infectados presentaron una viremia desde el día 2 post-inoculación (pi) hasta la muerte del animal o el fin del experimento en el día 34 pi, y desarrollaron anticuerpos neutralizantes a partir del día 18 pi. Los rebecos virémicos presentaron un descenso en el recuento leucocitario, especialmente significativo en los neutrófilos. Las lesiones más significativas se observaron en el encéfalo y órganos linfoides, que presentaron una meningoencefalitis no supurativa y una moderada depleción linfoide generalizada, respectivamente. De manera similar a los rebecos infectados de manera natural, los rebecos de este experimento también presentaron virus en hisopo nasal, saliva y heces, hecho que explicaría la elevada capacidad de transmisión horizontal observada en las poblaciones de rebecos salvajes afectadas por las epizootias. Esta infección experimental confirma que el ch-BDV es el agente etiológico primario de la enfermedad que ha afectado a las poblaciones de rebeco en los últimos años en el Pirineo. La Enfermedad de la Frontera en las ovejas cursa con un cuadro sintomático leve o subclínico, aunque se han descrito brotes de enfermedad con elevada mortalidad. En la infección experimental de oveja valoramos la susceptibilidad de esta especie al ch-BDV. No se observaron signos clínicos ni lesiones histopatológicas en los corderos inoculados aunque el BDV se detectó en suero entre los días 4 y 10 pi. Todos los corderos infectados mostraron anticuerpos neutralizantes a partir del día 21 pi. La conclusión principal de esta infección experimental fue que el ch-BDV infecta la oveja vía oro-nasal, desarrollando en ésta una respuesta humoral que elimina el virus. El BDV infecta diferentes especies animales. Previamente a la infección experimental en cerdo, habíamos detectado jabalíes con anticuerpos frente a BDV en las zonas del Pirineo donde se habían producido los brotes de enfermedad en rebeco. El objetivo principal de la infección experimental en el cerdo fue estudiar bajo condiciones experimentales los efectos del ch-BDV y la dinámica de la infección en esta especie. Los cerdos infectados mostraron una viremia desde el día 3 hasta el 14 pi, a partir del cual los animales desarrollaron una repuesta humoral. No se observó sintomatología clínica ni lesiones histológicas. Esta infección experimental demostró la susceptibilidad del cerdo al ch-BDV, lo que podría representar un problema en el diagnóstico de la Peste Porcina Clásica en el jabalí.

Since 2001 several outbreaks of disease associated with BDV infection have been reported in the Pyrenees (North-Eastern Spain), affecting Pyrenean chamois (Rupicapra pyrenaica) and entailing a major population reduction. However, the clinical disease observed in the affected chamois was not the typical one described in domestic animals. The present research aims to investigate the pathogenesis of the disease associated to chamois-BDV (ch-BDV) in naturally-infected chamois and in three experimental animal models: pig, sheep and Pyrenean chamois. The shedding, distribution and quantification of ch-BDV in the organs of naturally infected chamois was investigated as a previous step to the experimental challenges in the three animal models. Sera and all tissue samples were positive to RT-PCR and virus isolation in all studied chamois. Also, nasal, oral and rectal swabs and urine were RT-PCR positive in almost all analyzed samples, confirming that the virus is shed through the main excretion routes. In addition, sera were tested for BDV antibodies using an ELISA and seroneutralization tests, with negative results. Sequence analysis of the 5’ untranslated region (5’-UTR) confirmed that this virus was grouped into the BDV-4 genotype as reported in previous studies. The observation of a RT-PCR positive foetus in an adult female suggests that persistently infected animals could be possible. The aim of the experimental infection in Pyrenean chamois was to reproduce the disease reported in chamois in the field and to study it under experimental conditions. Seven chamois (five seronegative and two seropositive against BDV) were inoculated with a BDV isolated from a naturally-infected chamois and three animals were kept as controls. The five seronegative infected chamois were viraemic from day 2 post inoculation (pi) until the day they died or the end of the experiment on day 34 pi, and developed neutralizing antibodies from day 18 pi until the end of the study. There was also a progressive decline in their white blood cell counts, especially marked in the neutrophil count. The most consistent histopathological lesions were in brain and lymphoid tissues, where non-suppurative meningoencephalitis and generalized moderate lymphocyte depletion were observed, respectively. Like naturally infected chamois, experimentally infected animals also contained high doses of BDV in main putative excretion routes, which would explain the high transmission rate of the infection in free-ranging chamois populations in the Pyrenees. This experimental infection in chamois confirms that BDV is the primary agent of the disease that has been affecting chamois populations in recent years in the Pyrenees. Clinical manifestations of Border Disease in healthy sheep acutely infected are mild or unapparent, but a few outbreaks with high mortality have been reported. Sheep were experimentally infected with ch-BDV and examined the susceptibility to the infection of this species. Clinical signs or histological lesions were not observed in inoculated lambs but BDV was detected in sera from the infected group from day 4 pi to day 10 pi. All infected lambs showed neutralizing antibodies at day 21 pi. Therefore, ch-BDV can infect domestic sheep through the oro-nasal route, developing a humoral response that completely eliminates the virus. It is well documented that BDV can infect domestic and feral swine. In a previous study, seropositive wild boars against BDV were detected from the Pyrenees areas where chamois epizootics occurred. For this reason, experimentally the effects and dynamics of ch-BDV infection in domestic pig were studied. In this challenge all infected pigs were viraemic from day 3 to 14 pi, when all animals developed an antibody response. Clinical signs or histological lesions were not observed. Thus, the susceptibility of domestic swine to ch-BDV was demonstrated, representing a potential challenge to the monitoring of CSFV in wild swine populations.