Implication of TNF superfamily receptors and their functional antagonists in neuronal apoptotic cell death

Abstract

L'apoptosi pot ser induïda a través de nombrosos estímuls, entre els quals hi ha els<br/>receptors de mort. Per induir apoptosi TNF&#945; necessita la participació d'inhibidors de la<br/>transcripció d'ARN o de la síntesi proteica, com són ActD i CHX. En aquest estudi<br/>demostrem com la citotoxicitat de TNF&#945; en cèl·lules PC12 i en neurones corticals<br/>sensibilitzades amb ActD es dóna a través de l'activació de la caspasa iniciadora 8, de<br/>la generació de tBid i de la conseqüent activació de les pro-caspases-9 i -3. A més, el<br/>tractament amb TNF&#945;/ActD no indueix diferències detectables en l'expressió de<br/>proteïnes involucrades en el complex de senyalització de TNF&#945;. L'anàlisi de les<br/>principals proteïnes antiapoptòtiques, com són FLIP, IAPs i els membres de la família<br/>de Bcl-2, demostra que Bcl-xL endogen és capaç de regular l'apoptosi induïda per<br/>TNF&#945;, sense afectar l'activació de la via del factor de transcripció NF-&#954;B. La<br/>sobreexpressió de Bcl-xL dóna resistència a la mort promoguda per TNF&#945; i ActD, i la<br/>reducció dels seus nivells indueix mort cel·lular per mitjà de TNF&#945;, a través de<br/>l'activació de JNK. Per confirmar la rellevància de Bcl-xL en el senyal promogut per<br/>TNF&#945;, es va avaluar l'efecte de la reducció dels nivells basals de proteïnes<br/>antiapoptòtiques com Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w i Mcl-1, en el model cel·lular HeLa, on<br/>aquestes s'hi troben expressades de forma fisiològica, contràriament al que passa en<br/>les cèl·lules PC12, demostrant que Bcl-xL és la proteïna antiapoptòtica més rellevant<br/>en la protecció de la mort induïda per TNF&#945;.<br/>Per altra banda, l'apoptosi induïda per TNF&#945; pot ser deguda a l'acumulació d'elevats<br/>nivells de hemo lliure. El grup hemo sensibilitza les cèl·lules Hepa a l'acció citotòxica<br/>de TNF&#945; a través de la inducció d'estrès oxidatiu, que provoca un dany cel·lular que<br/>porta a l'activació de la via de JNK y de pro-caspasa-3. La producció de ROS i el dany<br/>induït per estrès oxidatiu, així com la mort induïda per TNF&#945;, conjuntament amb<br/>elevats nivells del grup hemo lliure, poden inhibir-se amb l'expressió de proteïnes<br/>protectores com HO-1 y H-Ferritina.

La apoptosis puede ser inducida a través de numerosos estímulos, entre los cuales los<br/>receptores de muerte. Para promover la apoptosis, TNF&#945; necesita la colaboración de<br/>inhibidores de la trascripción del RNA o de la síntesis proteica, como ActD y CHX. En<br/>este estudio demostramos como la citotoxicidad de TNF&#945; en células PC12 y en<br/>neuronas corticales sensibilizadas con ActD ocurre a través de la activación de la<br/>caspasa iniciadora 8, la generación de tBid y la activación de las pro-caspasas-9 y -3.<br/>Además no se detectan diferencias de expresión, inducidas por TNF&#945;/ActD, de<br/>proteínas involucradas en la formación del complejo de señalización de TNF&#945;. El<br/>análisis de las principales proteínas antiapoptóticas, como FLIP, IAPs y miembros de<br/>la familia de Bcl-2, demuestra que Bcl-xL es la molécula endógena capaz de regular la<br/>apoptosis promovida por TNF&#945;, sin afectar la activación de la vía del factor de<br/>trascripción NF-&#954;B. La sobre-expresión de Bcl-xL confiere resistencia a la muerte<br/>apoptótica mediada por TNF&#945; y ActD, y su disminución forzada es capaz de inducir<br/>muerte celular únicamente tratando con TNF&#945; por activación de JNK. Para confirmar la<br/>relevancia de Bcl-xL en la señal promovida por TNF&#945;, la represión de proteínas antiapoptóticas<br/>como Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w y Mcl-1 ha sido evaluada en el modelo de células<br/>HeLa, donde estas se expresan fisiológicamente al contrario que en las células PC12,<br/>demostrando que Bcl-xL es la proteína anti-apoptótica más importante en la protección<br/>de la muerte inducida por TNF&#945;.<br/>Por otra parte, la apoptosis mediada por TNF&#945; puede ser promovida por la<br/>acumulación de elevados niveles del grupo hemo libre. El grupo hemo sensibiliza las<br/>células Hepa a la acción citotóxica de la citoquina TNF&#945; a través de la inducción de<br/>estrés oxidativo, cuyo daño resulta en la activación de la vía de JNK y de pro-caspasa-<br/>3. La producción de ROS y el daño inducido por estrés oxidativo, así como la muerte<br/>inducida por elevados niveles del grupo hemo libre y de TNF&#945;, pueden inhibirse por la<br/>sobre-expresión de proteínas protectoras como HO-1 y H-Ferritina.

Apoptotic cell death is triggered by several different stimuli, among which death<br/>receptors. To induce apoptosis, TNF&#945; needs the cooperation of RNA transcription or<br/>protein synthesis inhibitor, i.e. ActD and CHX. In this study we demonstrate that ActD<br/>renders rat PC12 cells and primary mouse cortical neurons susceptible to the cytotoxic<br/>effect of TNF&#945; by the activation of the initiator caspase 8, generation of tBid and<br/>activation of pro-caspase-9 and -3. Proteins involved in TNF&#945; receptor signaling<br/>complex are not affected by TNF&#945;/ActD stimulation. However, the analysis of antiapoptotic<br/>proteins, e.g. FLIP, IAPs and Bcl-2 family members, demonstrates that Bcl-xL<br/>is the endogenous regulator of neuronal sensitivity to TNF&#945;-induced apoptosis and that<br/>it operates in a NF-&#954;B-independent manner. Bcl-xL overexpression completely protects<br/>against TNF&#945;/ActD-induced apoptosis, whereas its endogenous decrease sensitizes to<br/>TNF&#945; cytotoxic effect promoting JNK-dependent cell death. To point out the relevance<br/>of Bcl-xL in TNF&#945; signaling pathway, endogenous decrease of the main anti-apoptotic<br/>Bcl-2 family members, e.g. Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w and Mcl-1, was performed in HeLa cell<br/>line in which, contrarily to PC12, these proteins are expressed. The results obtained<br/>demonstrate that Bcl-xL is the most important Bcl-2-cytoprotective protein in regulating<br/>TNF&#945; cytotoxicity.<br/>Moreover, TNF&#945;-induced cell death is promoted by high levels of free heme<br/>accumulation. Heme sensitizes Hepa cell line to TNF&#945;-triggered apoptosis enhancing<br/>ROS production and ROS-mediated damage. This results in JNK and pro-caspase-3<br/>activation. Oxidative stress-promoted apoptosis induced by heme/TNF&#945; treatment is<br/>inhibited by the overexpression of HO-1 and H-Ferritin cytoprotective proteins.