Molecular mechanisms of ageing in neurodegeneration role of oxidative and endoplamic reticulum stress in different human diseases

Abstract

La hipòtesi de treball d'aquesta tesi es que les malalties neurodegeneratives<br/>poden considerarse formes accelerades de l'envelliment, selectives per a<br/>determinades localitzacions anatòmiques del teixit nerviós. D'acord a això, aquells<br/>processos subjacents a les bases biològiques de l'envelliment (estrès oxidatiu,<br/>accumulació de proteïnes agregades, disfunció mitocondrial) i les seves<br/>conseqüències son més intenses i prematures en aquestes poblacions cel.lulars.<br/>L'objectiu d'aquest treball es investigar la possible relació entre estrès oxidatiu i<br/>de retícle (ER) i les vies de senyalització iniciades per ambdós processos, com a<br/>mecanisme patogènic en el desenvolupament de les malalties neurodegeneratives, de<br/>diferents localitzacions i caracteritzades per la presència d'agregats proteics. Així,<br/>hem caracteritzat la modificació oxidativa proteica, els seus causants més importants i<br/>les seves conseqüències fisiopatològiques en la forma esporàdica de l'esclerosi lateral<br/>amiotròfica (ELA) amb inici lumbar, en la taupatia frontotemporal malaltia de Pick<br/>(MdP) i en la malaltia de granuls argirofílics (MGA). Els resultats dels analisis de<br/>mostres de pacients amb ELA s'han comparat amb els obtinguts en models in vitro de<br/>la malaltia.<br/>Desprès de la caracterització anatomopatològica exhaustiva, les mostres de<br/>mèdul.la espinal (ME) i d'escorça frontal (EF) de malalts amb ELA, d'escorça occipital<br/>(EO) i EF de malalts amb MdP, i d'hipocamp (HC) de malalts amb MGA, es varen<br/>analtizar en comparació amb mostres d'individus sans amb edats comparables. La<br/>concentració de marcadors de vies específiques de modificació oxidativa proteica<br/>(oxidació directa, glicoxidació i lipoxidació), així com la composició en àcids grasos es<br/>va analitzar mitjançant espectrometria de masses combinada amb separació<br/>cromotogràfica. Com a factors reguladors d'oxidació proteica es varen emprar la<br/>quantitat de complexes respiratoris mitocondrials, sistemes de defensa antioxidant i<br/>sistemes proteolíticis, estimats mitjançant western-blot. A més s'establí, emprant la<br/>mateixa metodologia, les conseqüències en forma d'ER i de resposta a proteïnes<br/>desplegades (RPD). Així mateix, s'estimà la biogènesi mitcondrial mitjançant anàlisi<br/>de la quantitat de factors reguladors de la mateixa, mitjançant western-blot.<br/>Les mostres dels pacients amb ELA mostraren increments en els marcadors<br/>d'oxidació directa, glicoxidació i lipoxidació en ME, i, de forma menys important, en<br/>mostres d'EF. Això s'associava a un increment en peroxidizabilitat lipídica, i a una<br/>disminució de respostes neuroprotectores, degut a la disminució en el contingut d'àcid<br/>docosahexaenoic, i a alteracions proteasomals i en el contingut de complexes<br/>respiratoris mitocondrials. Es va evidenciar estrés de reticle en ME, però no a l'EF.<br/>Així, es va concloure que l'ELA esporàdica duu a increments en lesió oxidativa<br/>proteica i a estrés de reticle en ME, mentres que a EF, hi ha menys afectació, bo i no<br/>estar indemne.<br/>D'altra banda, en mostres de EF, però no en EO de MdP, es varen detectar<br/>evidències compatibles amb estrés de reticle, com la RPD, associada a deplecció de<br/>xaperones de reticle. Aquestes troballes es relacionen amb un increment en la<br/>ubiquitinització, compatible amb alteracions en l'activitat proteasomal. En EF, es varen<br/>trobar increments en lesió oxidativa directa i lipoxidació, afectant a enzims<br/>antioxidants, amb disminució en la concentració de marcadors de glicoxidació.<br/>Sorprenentment, es varen evidenciar increments a la majoria de marcadors de lesió<br/>oxidativa en EO, localització morfològicament preservada a la MdP. Els canvis<br/>presents en aquesta malaltia s'associaven a canvis en la dotació de complexes<br/>respiratoris mitocondrials, compatibles amb pèrdues de biogenesi mitocondrial i de<br/>defensa antioxidant, combinats amb deplecció de l'àcid docosahexaenoic, considerat<br/>un neuroprotector, en EF. En aquest context, el contingut dels factors de transcripció<br/>relacionat amb respostes antioxidants i amb biogènesi mitocondrial, mostraren<br/>disminucions significatives en EF i de forma menys marcada, a EO. En contrast,<br/>mentres que a EO es va veure increment d'estrés oxidatiu, les cadenes respiratories<br/>mitocondrials i la biogenesi no semblaven afectades, de forma conjunta amb un<br/>increment d'àcid docosahexaenoic, suggerint una resposta apropiada a l'estrés<br/>oxidatiu.<br/>L'anàlisi dels marcadors d'estrés oxidatiu en HC de MGA revelaren<br/>disminucions significatives en marcadors de glicoxidació, de manera similar a MdP,<br/>troballes compatibles amb un dèficit glicolitic. Aquests defectes glicolítics, s'han descrit<br/>previament en altres malalties neurodegeneratives i podrien associarse a<br/>modificacions oxidatives d'enzims glicolítics, també evidenciats aquí. Això suggerreix<br/>un paper preferencial d'altres modalitats de lesió oxidativa, com la lipoxidació, com<br/>evidencien els increments en concentració de malondialdehid-lisina en aquesta<br/>malaltia. La medició dels carbonils proteics va reforçar l'existència d'estrés oxidatiu a<br/>HC, atribuible a la disfunció mitocondrial, evidenciada per canvis en complexes i en el<br/>nombre de mitocondris. Així mateix, diverses molecules clau en la RPD varen mostrar<br/>increments a les mostres procedents de malalts de MGA, causant increments a les<br/>xaperones de reticul endoplasmàtic. De forma remarcable, a pesar de les troballes<br/>compatibles amb la reducció mitocondrial, els factors transcripcionals implicats en la<br/>seva biogènesi no s'elevaren, suggerint que un defecte en biogènesi mitocondrial<br/>podria estar implicat a la patogenesi de la MGA.<br/>Els resultats descrits a la present memòria de tesi, indiquen la relació entre<br/>estrés oxidatiu i de retícul endoplasmàtic, en ELA, MdP i MGA, suggerint la seva<br/>relació recíproca, a travès de disfunció proteolítica, i un paper clau de la funció<br/>mitocondrial, o la seva pèrdua, conduint al procès neurodegeneratiu.

La hipótesis a contrastar en esta tesis es que las enfermedades<br/>neurodegenerativas (ENDs) pueden ser una forma acelerada del envejecimiento,<br/>selectiva para determinadas localizaciones anatómicas del tejido nervioso.<br/>Consiguientemente, aquellos procesos subyacentes en las bases biológicas del<br/>envejecimiento (estrés oxidativo, acumulación de proteínas con alto grado de<br/>agregación, disfunción mitocondrial) y sus consecuencias son más intensas y<br/>prematuras en estas poblaciones celulares.<br/>El objetivo de este trabajo es investigar la posible interrelación entre estrés<br/>oxidativo y de retículo (ER) y vías de señalización iniciadas por ambos procesos,<br/>como mecanismo patogénico en el desarrollo de ENDs de diferentes localizaciones y<br/>caracterizadas por la presencia de agregados proteicos. Así, hemos caracterizado la<br/>modificación oxidativa proteica, sus causantes más importantes y sus consecuencias<br/>fisiopatológicas en la forma esporádica de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) con<br/>inicio lumbar, en la taupatía frontotemporal enfermedad de Pick (EdP) y en la<br/>enfermedad de granos argirofílicos (EGA). Los resultados de los análisis de muestras de pacientes con ELA se ha comparado con los obtenidos en modelos in vitro de la<br/>enfermedad.<br/>Tras caracterización anatomopatógica exhaustiva, las muestras de médula<br/>espinal (ME) y de córtex frontal (CF) de pacientes de ELA; de córtex occipital (CO) y<br/>CF de enfermos de EdP, y de hipocampo (HC) de pacientes con EGA, se analizaron<br/>en comparación con muestras de individuos sanos con edades comparables. La<br/>concentración de marcadores de vías específica de modificación oxidativa proteica<br/>(oxidación directa, glicoxidación y lipoxidación), así como la composición en ácidos<br/>grasos se analizaron mediante espectrometría de masas combinada con<br/>cromatografía. Como factores reguladores de oxidación proteica se tomaron la<br/>cantidad de complejos respiratorios mitocondriales, sistemas de defensa antioxidante<br/>y sistemas proteolíticos, estimados mediante análisis de wester-blot. Además, se<br/>estableció mediante la misma metodología, las consecuencias en forma de ER y de<br/>respuesta a proteínas desplegadas (RPD). Asimismo, se estimó la biogenésis<br/>mitocondrial mediante análisis de la cantidad de factores reguladores de la misma,<br/>mediante western-blot.<br/>Las muestras con ELA mostraron incrementos en los marcadores de oxidación<br/>directa, glicoxidación y lipoxidación en ME, y, de forma menor cuantitativamente, en<br/>muestras de CF. Ello se asoció a un incremento en la peroxidizabilidad lipídica, y a<br/>una disminución de respuestas neuroprotectoras debido a la disminución en el contenido de ácido docosahexaenoico y a alteraciones del proteasoma y en el<br/>contenido de complejos respiratorios mitocondriales. Se evidenció estrés de retículo<br/>en ME, pero no en CF. Consiguientemente, se concluyó que la ELA esporádica<br/>conlleva incremento en lesión oxidativa proteica y a estrés de retículo en médula<br/>espinal, mientras que el CF, muestra menor afectación, pero no esta indemne.<br/>Por otro lado, en muestras de CF, pero no en CO de EdP, se detectaron<br/>evidencias de estrés de retículo, como RPD, asociadas a pérdida de chaperonas de<br/>retículo. Estos hallazgos se relacionan con un incremento en la ubiquitinización<br/>compatible con alteraciones en la actividad proteasomal. En esta localización (CF), se<br/>hallaron incrementos en lesión oxidativa directa y lipoxidación, dirigidas a enzimas<br/>antioxidantes, con disminución en la concentración de marcadores de glicoxidación.<br/>Sorprendentemente, se demostraron incrementos en la mayoría de marcadores de<br/>lesión oxidativa en CO, localización morfológicamente preservada en EdP. Los<br/>cambios presentes en esta enfermedad se asociaron a cambios en la dotación de<br/>complejos respiratorios mitocondriales, compatibles con pérdida de biogénesis<br/>mitocondrial y de defensa antioxiante, combinados con depleción del ácido<br/>docosahexaenoico, considerado como neuroprotector, en CF. En este contexto, el<br/>contenido de los factores de transcripción relacionados con respuestas antioxidantes<br/>y con biogénesis mitocondrial, mostraron cambios significativos en CF y menos<br/>marcados en CO. En contraste, mientras que en CO se observó incremento en lesión<br/>oxidativo en EdP, las cadenas respiratorias mitocondriales y la biogénesis podrían<br/>estar preservadas, de forma conjunta con un incremento de ácido docosahexaenoico,<br/>sugiriendo una respuesta apropiada al estrés oxidativo.<br/>El análisis de los marcadores de estrés oxidativo en HC de EGA revelaron<br/>disminuciones significativas en marcadores de glicoxidación, de modo similar a EdP,<br/>hallazgos compatibles con un déficit de glicolisis en esta situación. Estos defectos se<br/>han descrito previamente en otras ENDs y pueden asociarse a modificaciones<br/>oxidativas de enzimas glicolíticos, tambien evidenciados aquí. Ello sugiere un papel<br/>preferencial de otros modos de lesión oxidativa, como la lipoxidación, como evidencian los incrementos en concentración de malondialdehido-lisina en esta<br/>enfermedad. La medición, mediante western-blot, de los carbonilos proteicos reactivos<br/>reforzó la existencia de estrés oxidativo en HC, atribuible a la disfunción mitocondrial<br/>evidenciable por cambios en la función respiratoria y en su número. Asimismo,<br/>diversas moléculas clave en la RPD mostraron incrementos en las muestras<br/>procedentes de enfermos, causando incrementos en chaperonas de retículo<br/>endoplasmatico. De forma remarcable, a pesar del número reducido de mitocondrias,<br/>los factores transcripcionales implicados en su biogénesis no se elevaron, sugiriendo que un defecto en biogénesis mitocondrial puede estar implicado en la patogénesis de<br/>EGA.<br/>Los resultados descritos en esta memoria de tesis indican la interrelación entre<br/>estrés oxidativo y de retículo endoplasmatico, en ELA, EdP y EGA sugiriendo su<br/>relación recíproca a través de disfunción proteolítica, y un papel clave de la función<br/>mitocondrial, conduciendo al proceso neurodegenerativo.

It is hypothesized that the neurodegenerative diseases (NDDs) could be an<br/>accelerated form of aging selective for nervous tissue in specific anatomic locations.<br/>Accordingly, the processes observed in the biological basis of aging (oxidative stress,<br/>accumulation of highly modified protein aggregates, mitochondrial dysfunction) and the<br/>ensuing processes that it triggers are more intense and premature in these cell<br/>populations.<br/>The aim of this work was to investigate the potential interplay between<br/>oxidative and endoplasmic reticulum (ER) stress and the underling signalling<br/>pathways, as a potential mechanism involved in the pathogenesis of the<br/>neurodegenerative disorders affecting different locations, and characterized by protein<br/>aggregates. We characterized protein oxidative damage, its major contributors and its<br/>pathophysiological consequences in the sporadic form of amyotrophic lateral sclerosis<br/>(ALS) patients with lumbar onset disease, in the frontotemporal tauopathy Pick's<br/>disease (PiD) and in the argyrophilic grain disease (AGD) patients. The results of ALS<br/>samples were compared with in vitro models of the disease.<br/>After extensive pathological characterization, samples from spinal cords (SC)<br/>and frontal cortex (FC) from ALS patients, FC and occipital cortex (OC) from PiD<br/>patients, and hippocampus (HC) from AGD patients were analyzed in comparison with<br/>age-matched control samples. The concentration of markers for specific pathways of<br/>protein oxidative damage (direct oxidation, glycoxidation and lipoxidation) and fatty<br/>acid composition were assessed by mass spectrometry. Contributors to protein<br/>oxidation (mitochondrial respiratory complexes, antioxidant defence and proteolysis)<br/>and its consequences (endoplasmic reticulum stress and/or unfolded protein response<br/>(UPR)) were evaluated by western-blot of specific markers. Furthermore, the<br/>mitochondrial biogenesis system was assessed by measuring by western blot the<br/>levels of key factors.<br/>ALS was associated to increased direct oxidative, glycoxidative and lipoxidative<br/>damage in SC and, to a lower extent, in FC samples. This was associated to increased<br/>lipid peroxidizability, and to impaired neuroprotective responses because of decreased<br/>docosahexaenoic content as well as alterations of the mitochondrial respiratory<br/>complexes and proteasomal impairment. Endoplasmic reticulum stress was evidenced<br/>in SC, but not in FC. Therefore, it could be concluded that sporadic ALS leads to<br/>increased oxidative damage in proteins and to ER stress in SC, while FC is less<br/>affected, but not preserved.<br/>In samples from FC, but not in OC of PiD, there were evidences of ER stress<br/>such as activated UPR, associated to specific depletion in ER chaperones. Those<br/>findings are related to increased ubiquitination compatible with alteration in ubiquitinproteasome<br/>system. In the same location, evidences for increased direct oxidative and<br/>lipoxidative damages targeting antioxidant enzymes were found, with decreased<br/>amount of glycoxidation markers. Strinkingly, increases in most of the examined<br/>parameters of oxidative stress in morphologically preserved OC of PiD patients were<br/>detected as well. The changes registered in PiD could be associated with disturbances<br/>in mitochondrial respiratory complexes compatible with diminished mitochondrial<br/>biogenesis and lack of antioxidant defence, combined with depletion in the contents of<br/>the neuroprotective docosahexaenoic acid observed in FC. In this line, the content of<br/>the transcription factors related to antioxidant responses and mitochondrial biogenesis<br/>showed significant changes in FC but less marked in OC. In contrast, while OC<br/>showed increased oxidative damage, mitochondrial respiratory chain and biogenesis<br/>were preserved, a finding associated to increased docosahexaenoic content,<br/>suggesting an appropriate response to the generated increase in oxidative stress.<br/>Analysis of various oxidative stress biomarkers in HC of AGD revealed<br/>significantly decreased levels of the markers of glycoxidation, similarly to PiD, which is<br/>compatible with defects in glycolytic potential in this location. Those defects have been<br/>previously reported in other NDDs and may be associated to oxidative modifications of<br/>glycolytic enzymes also evidenced here. There were no changes in the concentrations<br/>of direct protein oxidation markers. This suggests a preferential role of other forms of<br/>oxidative damage, such as lipoxidation, as evidenced by increased malondialdehydelysine<br/>levels in this disease. Western blot measurements also revealed increased<br/>protein reactive carbonyl groups further supporting elevated oxidative damage in HC<br/>of AGD samples, which can be attributed to the mitochondrial dysfunction evidenced<br/>by disturbance in the respiratory chain function and reduced mitochondria number.<br/>Furthermore, the key molecules critically involved in UPR were found activated, which<br/>caused elevation in ER chaperones. Most importantly, despite the reduced number of<br/>mitochondria, transcription factors for their biogenesis were not increased, suggesting<br/>that impaired mitochondria biogenesis may be implicated in AGD pathogenesis.<br/>The described results indicate the implication of oxidative and endoplasmic<br/>reticulum stress in sporadic ALS, PiD and AGD suggesting a possible interplay<br/>between them through proteolysis dysfunction, with a predominant role of<br/>mitochondrial impairment leading to the neurodegenerative process.