TrkA COOH-terminal tail: its relevance on receptor stability and signaling for cell differentiation and survival

Abstract

El receptor del factor de creixement nerviós TrkA contribueix a la supervivència i a la<br/>diferenciació de diferents poblacions neuronals. Tot i que les principals vies de senyalització i<br/>molècules adaptadores activades després de la unió del lligant al receptor estan ben<br/>estudiades, recentment un creixent nombre de proteïnes que interaccionen amb TrkA han<br/>estat descrites com a nous mecanismes de regulació del receptor. La trans-autofosforilació<br/>del receptor, a més d'activar les cascades de senyalització rellevants per la diferenciació i<br/>supervivència cel·lular, com són les vies de les MAPKs i PI3K-Akt, també indueix un augment<br/>transitori de la concentració de calci citoplasmàtic. En conseqüència la proteïna sensora de<br/>Ca2+ calmodulina (CaM) també participa en la senyalització per TrkA. El nostre grup estava<br/>interessat en discernir la relació entre CaM i TrkA, i vàrem descobrir que CaM interacciona<br/>directament i de manera Ca2+-dependent amb l'extrem carboxi-terminal de TrkA. A partir<br/>d'aquests resultats ens vàrem plantejar de buscar la posició exacta del domini d'unió a<br/>calmodulina en la seqüencia de TrkA. Donat que els programes de predicció no van trobar una<br/>seqüència candidata d'unió a CaM en el domini intracel·lular del TrkA, vàrem centrar-nos en el<br/>extrem COOH-terminal del receptor, un domini ric en aminoàcids hidrofòbics en posicions<br/>conservades. Vàrem introduir mutacions en dos aminoàcids del domini candidat, Leu784 i<br/>Val790 substituint-los per Ala. Els assajos d'unió van mostrar que els mutants TrkA-L784A i<br/>TrkA-L784A-V790A no perdien la unió a CaM, per tant no formaven part del domini d'unió a<br/>CaM de TrkA. Tanmateix, vàrem demostrar que aquests aminoàcids hidrofòbics són importants<br/>per a la unió i la regulació de la lligasa d'ubiquitina Nedd4-2. Vàrem observar una forta<br/>interacció dels dos receptors mutants amb Nedd4-2, que es corroborava amb una augmentada<br/>co-localització de les dues proteïnes detectada per immunofluorescència. Com a conseqüència<br/>s'observà una intensa multimonoubiquitinització basal dels receptors mutants mitjançada per<br/>Nedd4-2. Aquests resultats correlacionen amb un important descens en la quantitat de<br/>receptor a causa d'un direccionament d'aquest cap als endosomes tardans/lisosomes. Tot<br/>plegat resultava en un increment en la degradació dels receptors mutats. Malgrat la reducció<br/>en la quantitat de receptors de membrana, els receptors TrkA mutats van ser capaços<br/>d'activar vies de senyalització, i fins i tot eren més eficients en promoure l'extensió de<br/>neurites que els receptors TrkA normals. Els nostres resultats demostren que la composició de<br/>l'extrem COOH-terminal de TrkA participa en la regulació de la unió i activitat de Nedd4-2.<br/>Així mateix, s'evidencia que la ubiquitinització de TrkA per Nedd4-2 promou el tràfic<br/>endosomal de TrkA cap als endosomes tardans/lisosomes augmentant d'aquesta manera la<br/>degradació del receptor. Per altra banda, s'observa que la multimonoubiquitinització de TrkA<br/>no interfereix en l'activació de les vies de senyalització, tanmateix potencia la senyalització del<br/>receptor conduent a la diferenciació cel·lular.

El receptor del factor de crecimiento nervioso TrkA contribuye a la supervivencia y<br/>diferenciación de varias poblaciones neuronales. A pesar del buen conocimiento de las<br/>principales vías de señalización y las proteínas adaptadoras activadas después de la unión del<br/>ligando al receptor, últimamente se ha descrito un número creciente de proteínas que<br/>interaccionan con el receptor participando en su regulación. La trans-autofosforilación del<br/>receptor, adicionalmente a la activación de vías de señalización relevantes para la<br/>diferenciación y la supervivencia celular, como son las vías de las MAPKs y PI3K-Akt, también<br/>conlleva un aumento transitorio del calcio citoplasmático. En consecuencia la proteína sensora<br/>de calcio calmodulina (CaM) también participa en la señalización por TrkA. Nuestro grupo tenía<br/>interés en estudiar la relación entre CaM y TrkA y descubrió que la CaM interacciona de forma<br/>directa y calcio dependiente con el extremo COOH-terminal del receptor TrkA. A partir de<br/>estos resultados nos plantemaos buscar la posición exacta del sitio de unión a calmodulina<br/>dentro de la secuencia de TrkA. Puesto que los programas de predicción no encontraron<br/>ninguna secuencia candidata de unión a calmodulina en el dominio intracelular de TrkA, nos<br/>centramos en el extremo COOH-terminal, dominio rico en ácidos hidrofóbicos en posiciones<br/>conservadas. Introducimos mutaciones puntuales en el sitio candidato de unión a CaM<br/>cambiando la L784 y la V790 por Ala. Los ensayos de unión a CaM realizados mostraron que<br/>los mutantes TrkA-L784A y TrkAL784A-V790A no perdían la unión a CaM, por lo tanto no<br/>formaban parte del dominio de unión a CaM de TrkA. Sin embargo, hemos demostrado que<br/>estos aminoácidos son importantes para la unión y la regulación de la ligasa de ubiquitina<br/>Nedd4-2. . Observamos una mayor interacción de los dos mutantes del extremo COOHterminal<br/>con Nedd4-2, resultado que era corroborado por una mayor colocalización de las dos<br/>proteínas detectada por immunofluorescencia. Como consecuencia observamos una intensa<br/>multimonoubiquitinización basal de los receptores mutados mediada por Nedd4-2. Estos<br/>resultados correlacionan con un importante descenso de la cantidad de receptor a causa de<br/>un direccionamiento de este hacia los endosomas tardíos/lisosomas. Todo ello resultaba en un<br/>incremento en la degradación de los receptors mutados. A pesar de la reducción en la cantidad<br/>de receptor en membrana, los mutantes de TrkA mostraron ser capaces de activar las vías de<br/>señalización e incluso ser más eficientes promoviendo el crecimiento de neuritas comparando<br/>con el receptor normal. Estos resultados demuestran que la composición del extremo COOHterminal<br/>de TrkA regula la unión y la actividad de la ligasa de ubiquitina Nedd4-2. Además, la<br/>ubiquitinización de TrkA mediada por Nedd4-2 promueve el direccionamiento de los receptores<br/>mutados hacia los endosomas tardíos/lysosomas dando lugar a una mayor degradación del<br/>receptor. Por otro lado, se observa que la multimonoubiquitinización de TrkA no interfiere con<br/>la activación de las vías de señalización, sino más bien potencia la señalización del receptor<br/>que conduce a la diferenciación celular.

The nerve growth factor receptor TrkA contributes to the survival and<br/>differentiation of several neuronal populations. Although main signaling pathways<br/>and adaptor molecules activated after ligand binding to the receptor are well studied,<br/>recently a growing number of TrkA interacting proteins have been described as novel<br/>mechanisms of receptor regulation. Receptor trans-autophosphorylation, additionally<br/>to activating signaling cascades relevant for cell differentiation and survival, such as<br/>MAPKs and PI3K-Akt, also induces a transient increase in intracellular calcium<br/>concentration. Therefore, the Ca2+ sensor calmodulin (CaM) also participates in TrkA<br/>signaling. Our group was interested in elucidating the relationship between CaM and<br/>TrkA, and discovered that CaM interacts directly with the C-terminal tail of TrkA in a<br/>Ca2+ dependent manner. Consequently, we sought to find the exact position of the<br/>calmodulin binding site on TrkA sequence. Since available prediction software was<br/>unable to find a putative CaM binding site in TrkA intracellular domain, we focused<br/>on the C-terminal tail, a domain rich in hydrophobic amino acids in conserved<br/>positions. We introduced point mutations on Leu784 and Val790 by switching them<br/>to Ala, located on our predicted CaM binding site. However, TrkA-L784A and TrkAL784A/<br/>V790A mutants did not lose CaM binding, therefore they were not involved on<br/>CaM binding. Nonetheless, we demonstrated that these hydrophobic aminoacids are<br/>important for the binding and regulation of Nedd4-2 Ub ligase. We observed a<br/>stronger interaction of both C-terminal mutant receptors with Nedd4-2, corroborated<br/>with a higher colocalization of both proteins by immunofluorescence. Consequently,<br/>we observed an enhanced basal multimonoubiquitination of mutant receptors by<br/>Nedd4-2. These results correlated with a decrease in TrkA abundance due to a faster<br/>late endosome/lysosome targeting, leading to a higher degradation rate of mutant<br/>receptors. Despite the reduction in the amount of membrane receptor caused by the<br/>C-terminal changes, TrkA mutants were able to activate signaling cascades and were<br/>even more efficient in promoting neurite outgrowth than the wild-type receptor. Our<br/>results demonstrate that the C-terminal tail conformation of TrkA regulates Nedd4-2<br/>binding and activity. Moreover, TrkA ubiquitination by Nedd4-2 promotes TrkA<br/>endosomal trafficking to late endosome/lysosome leading to receptor degradation. In<br/>addition, TrkA multimonoubiquitination does not interfere with the activation of<br/>signaling cascades, but rather potentiates receptor signaling leading to<br/>differentiation.