Transloquina, una proteïna associada a microtúbuls, regula la localització de la ciclina D1 en cèl·lules quiescents

Abstract

<p style="text-align:justify">El cicle cellular és el conjunt d'esdeveniments ordenats que permeten a la cèllula donar lloc a dues cèllules filles genèticament idèntiques. Diversos senyals externs i interns regulen aquest procés per a que la cèllula proliferi només en les condicions apropiades. Un punt de control important pel que fa a la coordinació de la proliferació amb el creixement cellular es troba en la fase G1 (punt de restricció), on la cèllula comprova que ha adquirit la massa i la maquinària necessària per la replicació del DNA. Les ciclines D són molècules que juguen un paper clau en la regulació de la fase G1. Les cèllules de mamífer contenen gens que codifiquen per 3 ciclines de tipus D altament homòlogues (D1, D2, D3), que s'expressen de manera específica de teixit i s'associen a Cdk4 o Cdk6 per formar una proteïna quinasa activa. D'aquestes tres ciclines la ciclina D1 és la més estudiada ja que es troba freqüentment superexpressada en molts càncers humans. L'expressió de ciclina D1 i la seva unió a Cdk4 representa un dels esdeveniments més importants, regulats per senyals mitogènics, necessaris per la progressió del cicle cellular a través del punt de restricció. <br/>Les cèllules inhibeixen l'entrada en cicle en la fase G1 principalment per dos mecanismes diferents: la disminució de l'expressió de ciclines D i l'augment de les proteïnes KIP que inhibeixen l'activitat residual del complex Cdk4/6ciclina D. Tot i discrepàncies d'origen metodològic, diferents estudis han observat l'acumulació de la ciclina D1 en el citoplasma de cèllules quiescents o diferenciades, suggerint l'existència d'altres mecanismes que podrien regular l'activitat dels complexes Cdk4ciclina D1 a nivell de la seva distribució nucleocitoplasmàtica. D'altra banda, en el nostre laboratori s'havia desvetllat un mecanisme de retenció citoplasmàtica de Cln3, l'homòleg funcional de ciclina D1 en llevat de gemmació, que regula l'entrada en cicle i juga un paper molt important en la coordinació entre creixement i proliferació. Aquests antecedents ens van conduir a plantejar com a hipòtesi de treball d'aquesta tesi doctoral l'existència d'un mecanisme de control de la localització de la ciclina D1 entre el nucli i el citoplasma, que podria tenir un paper especialment rellevant en situacions d'aturada de la proliferació cellular. <br/>En aquest treball hem demostrat que la ciclina D1 es localitza en el citoplasma de fibroblasts embrionaris de ratolí quiescents, i que això succeeix per un mecanisme independent de l'export mediat per Crm1. De la cerca d'interactors de ciclina D1 per dihíbrid i copurificació hem identificat la transloquina, una proteïna que havia estat descrita com a important en el procés d'import nuclear de FGF2. En observar durant el nostre treball que FGF2 és un potent estimulador de l'acumulació nuclear de ciclina D1, varem decidir analitzar en detall les seves implicacions funcionals. La superexpressió de transloquina inhibeix l'acumulació nuclear de ciclina D1 en cèllules proliferant. En canvi, la inhibició de l'expressió de transloquina causa l'efecte oposat, és a dir, indueix l'acumulació nuclear de ciclina D1 i la fosforilació de RB per Cdk4 en cèllules sotmeses a condicions de quiescència. <br/>En resum, en aquest treball de tesi doctoral hem desvetllat i descrit un mecanisme de retenció citoplasmàtica de la ciclina D1 en fibroblasts embrionaris de ratolí, on la transloquina hi juga un paper important per a mantenir l'estat de quiescència cellular. La transloquina i Cdk4 s'uneixen i competeixen pel mateix domini de ciclina D1 i, donat que cal la formació prèvia del complex Cdk4ciclina D1 per al seu import nuclear, aquest fet permet establir una base molecular senzilla pel propi mecanisme de retenció citoplasmàtica.

</b><br/><br><br/><br><br/><p style="text-align:justify"><br/>El ciclo celular es el conjunto de sucesos ordenados que permiten a la célula originar dos células hijas genéticamente idénticas. Distintas señales internas y externas regulan este proceso para que las células proliferen sólo en las condiciones más apropiadas. Uno de los puntos de control importantes, donde se coordina la proliferación con el crecimiento celular se encuentra en la fase G1 (punto de restricción). En este punto la célula comprueba que ha adquirido la masa y la maquinaria necesaria para la replicación del DNA. Las ciclinas D son moléculas que tienen un papel clave en la regulación de la fase G1. Las células de mamífero contienen genes que codifican para tres ciclina tipo D altamente homólogas (D1, D2, D3), que se expresan de forma específica de tejido y se asocian a Cdk4 o Cdk6 para formar una proteína quinasa activa. Entre las tres ciclinas, la ciclina D1 es la más estudiada, ya que se encuentra sobrexpresada en muchos cánceres humanos. La expresión de ciclina D1 y su unión con Cdk4 representa uno de los acontecimientos más importantes, regulados por señales mitogénicas, necesarios para la progresión del ciclo celular a través del punto de restricción. <br/>Las células inhiben la entrada en ciclo en la fase G1 principalmente por dos mecanismos distintos: la disminución de la expresión de ciclinas D y el aumento de las proteínas KIP que inhiben la actividad residual del complejo Cdk4/6ciclina D. A pesar de alguna inconsistencia de origen metodológico, distintos estudios han observado la acumulación de la ciclina D1 en el citoplasma de células quiescentes o diferenciadas, sugiriendo la existencia de otros mecanismos que podrían regular la actividad de los complejos Cdk4ciclina D1 a nivel de su localización núcleocitoplasmática. Por otro lado, en nuestro laboratorio se había descrito un mecanismo de retención citoplasmática de Cln3, el homólogo funcional de ciclina D1 en levadura de gemación, que regula la entrada en ciclo y juega un papel muy importante en la coordinación entre crecimiento y proliferación. Estos antecedentes nos llevaron a plantear, como hipótesis de trabajo de esta tesis doctoral, la existencia de un mecanismo de control de localización de ciclina D1 entre el núcleo y el citoplasma, que podría tener un papel relevante en situaciones de detención de la proliferación celular. <br/>En este trabajo hemos demostrado que la ciclina D1 se localiza en el citoplasma de fibroblastos embrionarios de ratón quiescentes, y que además sucede por un mecanismo independiente del exporte por Crm1. De la búsqueda de interactores de ciclina D1 por dihíbrido y copurificación hemos identificado la transloquina, una proteína cuya implicación ya se había descrito en el proceso de importe nuclear de FGF2. Además, durante nuestro trabajo observamos que FGF2 es un potente estimulador de la acumulación nuclear de ciclina D1. La sobreexpresión de transloquina inhibe la acumulación nuclear de ciclina D1 en células proliferando. En cambio, la inhibición de la expresión de transloquina causa un efecto opuesto, induce la acumulación nuclear de ciclina D1 y la fosforilación de RB por Cdk4 en células sometidas a condiciones de quiescencia. <br/>En resumen, en este trabajo de tesis doctoral hemos identificado un mecanismo de retención citoplasmática de la ciclina D1 en fibroblastos embrionarios de ratón, donde la transloquina juega un papel importante para mantener el estado de quiescencia celular. La transloquina y Cdk4 se unen y compiten por el mismo dominio de ciclina D1, y puesto que la formación del complejo Cdk4ciclina D1 es un requisito previo para el importe nuclear, este hecho permite establecer una base molecular sencilla para el propio mecanismo de retención citoplasmática.

</b><br/><br><br/><br><br/><p style="text-align:justify"><br/>The cell cycle is the series of events by which the cell duplicates its contents and divides into two daughter cells identical genetically. This process is regulated by different external and internal signals allowing the cell to proliferate under suitable conditions. Higher eukaryotes control proliferation and growth in late G1 at the restriction point, where they ensure that enough appropriate nutrients and extracellular mitogens are present to enter a new cell cycle and initiate DNA replication. Dtype cyclins are a key target in the regulation of G1 phase. Mammalian cells contain genes encoding three highly homologous Dtype cyclins (D1, D2, D3) that associate in a tissue specific manner with either Cdk4 or Cdk6 to form an active protein kinase. Among them, cyclin D1 is the most studied because its overexpression is frequently present in human tumors. Mitogendriven upregulation of cyclin D1 levels and assembly into active complexes with Cdk4/6 are key events for exit from quiescence and G1 progression in mammalian cells. <br/>Quiescent cells are thought to inhibit cell cycle entry mainly by two different mechanisms: downregulation of Dtype cyclin expression and upregulation of KIP proteins to inhibit residual Cdk4/6cyclin D activity. However, cytoplasmic accumulation of cyclin D1 in quiescent or differentiated cells has been observed in different instances, suggesting the existence of other mechanisms to control the nucleocytoplasmic distribution of cyclin D1 as a function of growth signals. On the other hand, we have previously characterized a cytoplasmic retention device that sequesters Cln3, the functional homologue of Dtype cyclins in budding yeast, to regulate G1 progression and cell size homeostasis. Thus, as the initial hypothesis of this doctoral thesis, we asked whether mammalian cells control the nucleocytoplasmic distribution of cyclin D1 as a function of growth signals. <br/>In this doctoral thesis we show that cyclin D1 is localized in the cytoplasm in quiescent mouse fibroblasts by a mechanism that does not involve the Crm1 exportin. We have screened for cyclin D1 interactors by twohybrid and coimmunopurification strategies and we have identified translokin, a protein that interacts with FGF2 and facilitates its nuclear import. We have also observed that FGF2 treatment of quiescent cells causes nuclear accumulation of cyclin D1. Overexpression of translokin prevents proper cyclin D1 accumulation in the nucleus of proliferating cells. On the other hand, downregulation of translokin levels results in nuclear accumulation of cyclin D1 and causes Cdk4dependent phosphorylation of RB in quiescent cells. <br/>In summary, in the present doctoral thesis we show that cyclin D1 is also subject to an analogous but different cytoplasmic retention mechanism in quiescent mouse fibroblasts. We have identified translokin as an interactor of cyclin D1 that plays an essential role to inhibit its accumulation in the nucleus under quiescence conditions. As translokin interacts with cyclin D1 domains also needed for Cdk4 binding and subsequent nuclear import, we propose that translokin is an essential component of a cytoplasmic retention mechanism of cyclin D1 that prevents cell cycle entry during cellular quiescence.