Epidemiologia molecular de les betalactamases AmpC plasmídiques en enterobacteris aïllats a l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau i la seva difusió horitzontal

Abstract

Les betalactamases AmpC plasmídiques (pACBL) es varen descriure a finals de la dècada dels 80 i es caracteritzen per presentar un patró fenotípic indistingible a la hiperproducció d’una betalactamasa AmpC cromosòmica, sent per tant resistents a les penicil·lines, cefalosporines de primera, segona i tercera generació, monobactàmics i combinacions amb inhibidors, mantenintse únicament sensibles a cefalosporines de quarta generació i carbapenèmics. La detecció de les pACBL suposa tot un repte per als laboratoris de microbiologia clínica degut a la falta de mètodes fenotípics estandarditzats. En l’estudi nacional de control de qualitat que hem realitzat, s’observa que la capacitat dels centres espanyols per a detectar i informar la producció de betalactamases d’espectre ampliat (BLEA) en aïllats de Klebsiella pneumoniae i Escherichia coli és molt superior a la capacitat per a detectar i informar la producció d’enzims AmpC en aquestes espècies. Recentment s’han desenvolupat mètodes comercials per a la detecció fenotípica de pACBL al laboratori. El problema és que aquests mètodes no són vàlids per a detectar pACBL en microorganismes productors d’una AmpC cromosòmica natural. No obstant, la presència de colònies situades a la proximitat dels halos d’inhibició de cefoxitina, cefotaxima, ceftazidima i aztreonam s’ha descrit com un possible indicador de la presència d’aquests enzims en Escherichia coli. Aquesta va ser l’única eina fenotípica que ens ha permès sospitar la presència d’una pACBL en una soca productora d’una AmpC cromosòmica natural, descrivint per primer cop una pACBL en una soca de Serratia marcescens. En aquest estudi, s’ha suggerit també la transferència horitzontal in vivo d’un plasmidi de 70 kb portador dels gens blaDHA-1 i qnrB entre aïllats de S. marcescens i d’E. coli. L’increment del nombre de soques productores de pACBL i els escassos estudis de prevalença d’aquests enzims a l’Estat Espanyol va propiciar la realització d’un estudi per a determinar la prevalença de pACBL en enterobacteris sense AmpC cromosòmica induïble. Les soques d’estudi foren aïllades entre 1999 i 2007 a l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Encara que la prevalença global ha estat del 0,4%, s’observa un increment significatiu del 0,06% el 1999 a l’1,3% el 2007. Proteus mirabilis ha sigut l’espècie productora de pACBL més prevalent (1%). Del total de 117 pACBL caracteritzades durant aquest període, CMY-2 és l’enzim majoritari (67%), seguit de DHA-1 (26%). Altres pACBL aïllades amb menor proporció són ACC-1, CMY-4, CMY-25, CMY-27 i CMY-40, sent les tres últimes variants de CMY-2 descrites per primer cop. El continu augment de la prevalença d’aquests enzims es deu principalment a la disseminació dels gens ampC per transferència horitzontal. A dia d’avui, encara existeix poca informació disponible sobre el tipus de vectors implicats en la seva expansió. És per aquest motiu que es va procedir a la caracterització dels vectors que mobilitzen els gens ampC en la col·lecció de soques del present estudi. Els resultats han mostrat que els gens ampC estan mobilitzats per plasmidis en el 84% (98/117) de les soques mentre que en el 6% (7/117) dels casos es mobilitzen via Integrative conjugative elements (ICE) de la família SXT/R391. L’anàlisi plasmídica mostra una estreta relació entre el gen ampC i el plasmidi implicat. En el 6% dels casos on els gens ampC han estat mobilitzats per ICE, es tracta de soques de P. mirabilis productores de blaCMY-2. El fet que un ICE sigui el responsable de la mobilització dels gens blaCMY-2 en el 37% de les soques de P. mirabilis i que recentment s’hagi aïllat una soca de P. mirabilis portadora de blaCMY-2 al Japó fa pensar que aquests elements juguen un paper molt important en la disseminació de blaCMY-2, almenys en aquesta espècie en els darrers anys. El transposó Tn10 sembla ser el responsable de la mobilització de blaCMY-2 a l’interior de l’ICE. Els entorns genètics dels gens blaCMY-2,-4,-25,-27 i -40 i blaACC-1 explorats són molt conservats, relacionant-se en tots els casos amb l’element mòbil ISEcp1. En canvi, els entorns genètics dels gens blaDHA-1 presenten una major variabilitat, relacionant-se principalment amb els gens conservats de l’extrem 3’CS d’un integró de classe 1, qacEΔ1 i sul1, i l’element mòbil IS26. De la mateixa manera que ocorre amb les soques portadores de BLEA, els plasmidis que vehiculen els gens ampC solen contenir altres gens que confereixen resistència a altres famílies d’antibiòtics, limitant encara més les opcions terapèutiques. L’estudi de sensibilitat mostra un elevat grau de resistència a la majoria dels antibiòtics no betalactàmics testats en les soques clíniques. La resistència a àcid nalidíxic s’ha transferit per conjugació en el 62% de les soques productores de DHA-1. Des de fa uns anys s’ha constatat una clara associació entre blaDHA-1 i els gens qnr (gens que confereixen resistència de baix nivell a quinolones). En la majoria de casos ambdós gens s’han trobat al mateix plasmidi, associats a integrons o transposons compostos. La co-localització dels gens qnrB i blaDHA-1 en plasmidis d’ampli rang d’hostatger, principalment IncL/M, s’ha demostrat en totes les soques estudiades. L’anàlisi de l’entorn d’una d’elles revela que ambdós gens es troben mobilitzats per un transposó IS26 compost, sent el primer cop que es detalla aquesta estructura en una soca d’E. coli.

Plasmid-mediated AmpC -lactamases (pACBL) were first described in the late 1980s. The phenotype of these enzymes is indistinguishable from the phenotype of hyperproducing chromosomal AmpC -lactamases. Thus, pACBL confer resistance to penicillins, first, second and third generation cephalosporins, monobactams and -lactamase inhibitors, and they are only susceptible to fourth generation cephalosporins and carbapenems. Detecting pACBL is a great challenge for microbiological laboratories because standardised phenotypic methods are lacking. The results of a proficiency study that we developed and conducted in Spain showed that the ability of microbiological laboratories to detect and report extended-spectrum -lactamases (ESBL) in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli was greater than the ability to detect and report AmpC enzymes in these isolates. Commercial methods have recently been developed to detect the pACBL phenotype in the laboratory. Their main problem is that they do not allow differentiation between chromosomal and acquired AmpC enzymes. Nevertheless, the presence of scattered colonies near the edge of the inhibition zones of cefoxitin, cefotaxime, ceftazidime and aztreonam has been described as a possible indicator of the presence of these enzymes in Escherichia coli. This was the only phenotypic tool that led us to suspect the presence of a pACBL in a chromosomal AmpC producer, thus, allowing the detection of a pACBL in a S. marcescens for the first time. Findings in this study also suggested in vivo horizontal transfer of a 70 kb IncL/M plasmid coharbouring blaDHA-1 and qnrB resistance genes between S. marcescens and E. coli isolates. The increasing number of pACBL-producing isolates and the few studies of prevalence based on these enzymes in Spain led us to conduct a study to determine the prevalence of pACBL in Enterobacteriaceae isolates lacking inducible chromosomal ampC genes. These isolates were collected from 1999 to 2007 at Hospital de la Santa Creu i Sant Pau in Barcelona, Spain (Annex III). Although the overall prevalence was 0.4%, we observed a significant increase, from 0.06% in 1999 to 1.3% in 2007. Proteus mirabilis showed the highest prevalence (1%). Among the 117 pACBL characterised during this period, CMY-2 was the most predominant enzyme (67%), followed by DHA-1 (26%). Less commonly found enzymes were ACC-1, CMY-4, CMY-25, CMY-27 and CMY-40. The latter three CMY-2-variants mentioned are reported in this study for the first time. The continuous increase in the prevalence of AmpC enzymes is mainly due to the spread of ampC genes by horizontal transfer. Nowadays, there is little information available among the kind of vectors involved in their spread. For this reason, we characterized vectors mobilising ampC genes. Results show that ampC genes were mobilised by plasmids in 84% (98/117) of the strains, whereas 6% (7/117) of cases were mobilised through integrative conjugative elements (ICE) belonging to the SXT/R391 family. Plasmid analyses revealed a close relationship between the plasmid-mediated ampC gene and the specific plasmid family involved. In six percent of the cases in which ampC genes were mobilised by an ICE, all of them were CMY-2 producing P. mirabilis. The fact that an ICE was responsible for mobilising blaCMY-2 genes in 37% of P. mirabilis isolates and that a CMY-2 producing P. mirabilis strain was recently described in Japan suggests that these elements play an important role in the dissemination of blaCMY-2, at least in this species in recent years. The Tn10 transposon seems to be responsible for mobilising blaCMY-2 inside the ICE. The regions surrounding blaCMY-2,-4,-25,-27,-40 and blaACC-1 were highly conserved. In all cases they were associated with the ISEcp1 mobile element. The regions surrounding blaDHA-1 were more variable and mainly associated with the conserved genes of the 3’CS of class 1 integrons, qacEΔ1 and sul1, and the IS26 mobile element. As occurs for ESBL-producing strains, plasmids carrying ampC genes usually contain other genes that confer resistance to other antibiotic families. This limits the therapeutic options even further. Susceptibility testing results displayed a high level of resistance to most non--lactam agents tested in clinical isolates. The nalidixic acid resistance determinant was transferred by conjugation in the 62% of DHA-1-producing Enterobacteriaceae. A clear association between blaDHA-1 and qnr genes (genes that confer a low level resistance to quinolones) have been reported in recent years. In most cases both genes are located on the same plasmid, associated with integrons or composite transposons. Co-localization of qnrB and blaDHA-1 genes on broadhost- range plasmids, all but one belonging to the IncL/M group, was demonstrated in all the studied isolates. Analysis of the genetic environment of one of the isolates revealed that both genes were mobilised through an IS26 composite transposon. This is the first time that this genetic structure is detailed in an E. coli strain.