Ochratoxin A and ochratoxigenic modulds in grapes, must and wine. Ecophysiological studies

Abstract

L'ocratoxina A (OTA) és un metabolit secundari tòxic produït essencialment per fongs<br/>dels gèneres Aspergillus i Penicillium, sota diverses condicions. La seva presència en el<br/>cos humà es deguda a la ingestió de petites quantitats provingudes d'un ampli ventall<br/>d'aliments, tant d'origen vegetal com animal. Després dels cereals, el vi és l'element en la<br/>dieta europea que més contribueix a l'ingesta d'OTA.<br/>L'OTA és una potent toxina que afecta principalment els ronyons, on pot provocar tant<br/>lesions agudes com cròniques. A part de la nefrotoxicitat, estudis toxicològics amb<br/>animals han demostrat que també te propietats genotòxiques, carcinogèniques i<br/>immunosupressives. A més, es sospita que és la causa d'una malaltia mortal per als<br/>humans observada en l'Europa de l'Est i coneguda com la 'Nefropatia Endèmica dels<br/>Balcans', així com de la formació de tumors en el tracte urinari d'humans.<br/>Breument, els objectius del present treball són: (i) fer una valoració del nivell de<br/>contaminació per OTA en begudes espanyoles derivades del raïm i estudiar la possible<br/>influència de diverses variables en el contingut d'OTA de vins i productes derivats; (ii)<br/>estudiar la micoflora de diverses vinyes espanyoles durant quatre anys consecutius<br/>mitjançant mostrejos de camp, per tal d'aclarir on, quan i fins a quin punt existeix OTA<br/>en aquest país; (iii) identificar i estudiar l'efecte de diversos factors ecofisiològics i de les<br/>seves interaccions en fongs potencialment productors d'OTA aïllats de raïm de<br/>vinificació, per tal de trobar les condicions que puguin minimitzar o prevenir el seu<br/>creixement i la formació de la toxina. Es van dur a terme estudis addicionals per<br/>investigar, en primer lloc, els efectes in vitro de l'aplicació de fungicides en raïm, i tot<br/>seguit, l'efecte del diferents tractaments fungicides en raïm al camp. També s'ha<br/>aconseguit visualitzar la colonització i els primers estadis d'infecció d'Aspergillus<br/>carbonarius en raïm, amb l'ajut de la microscopia de fluorescència làser confocal, epi- i<br/>estereomicroscopia, desprès de transformar aquest fong amb el gen de la proteïna de<br/>fluorescència verda (gfp).<br/>S'ha vist que prop d'un 20 % dels vins espanyols analitzats contenien OTA, la majoria a<br/>concentracions per sota dels límits establerts per la UE, i que els Aspergillus negres són<br/>els responsables de la producció d'aquesta toxina en aquest país, sobretot Aspergillus<br/>carbonarius. Malgrat el domini de les espècies de l'agregat A. niger en el raïm, i degut a<br/>la seva modesta capacitat de produir la toxina i a les baixes quantitats produïdes, la seva<br/>contribució al problema de l'OTA és ínfima. Les espècies uniseriades foren descartades<br/>en aquest aspecte, doncs no es va detectar toxina en cap de les soques aïllades.<br/>Els Aspergillus negres foren presents en el raïm des del quallat fins a la collita, en la<br/>majoria de vinyes. Tanmateix, la seva incidència augmentà amb la maduració del raïm,<br/>doncs les altes temperatures i humitat afavoriren el desenvolupament i producció d'OTA<br/>d'aquests fongs. Es va demostrar l'habilitat d'A. carbonarius de créixer en l'interval 10-<br/>45 ºC i 0,88-0,995 d'activitat d'aigua (aw), amb l'òptim al voltant de 30 ºC i a les més<br/>altes aw. Les condicions de temperatura favorables per a la producció d'OTA foren més<br/>restringides, essent 20 ºC i les altes aw les condicions òptimes. També s'estudiaren altres<br/>factors ecofisiològics com el país d'origen de les soques, les condicions de fotoperiode, l'<br/>alternança de temperatures, etc., doncs el coneixement dels factors que donen lloc a la<br/>producció d'OTA pot ajudar a dissenyar estratègies per limitar la seva formació.<br/>En la part final d'aquesta tesi s'han suggerit diverses maneres de prevenir i controlar els<br/>Aspergillus negres i la seva micotoxina. Com que s'ha vist que la producció d'OTA per<br/>Aspergillus negres és òptima poc temps desprès de la seva inoculació, la reducció del<br/>temps de collita i transport al celler serà decisiva per reduir els nivells d'aquesta toxina.<br/>També s'ha de procurar minimitzar els danys en la pell del raïm, doncs s'ha vist que les<br/>obertures fomenten la entrada del fong que es troba colonitzant la superfície,<br/>probablement afavorint la màxima producció d'OTA. L'execució d'altres mesures<br/>preventives com el control de fongs patògens i d'insectes durant el creixement del raïm -<br/>es varen fer assaigs amb diversos fungicides in vitro i in vivo-, i d'altres bones pràctiques<br/>agronòmiques, poden ajudar a reduir la contaminació per OTA del raïm.<br/>Com a conclusió general, s'ha vist que diversos factors poden ajudar a prevenir el<br/>desenvolupament dels fongs ocratoxigènics, però és necessari aplicar un sistema de<br/>mètodes combinats per tal de controlar el creixement i subseqüent producció d'OTA per<br/>aquests microorganismes. Les mesures preventives són sempre preferibles a les accions<br/>correctores, i junt amb un degut control de l'OTA en els derivats del raïm, asseguraran<br/>una adequada protecció del consumidor.

La ocratoxina A (OTA) es un metabolito secundario tóxico producido esencialmente por<br/>hongos de los géneros Aspergillus y Penicillium, bajo diversas condiciones. Su presencia<br/>en el cuerpo humano es debida a la ingestión de pequeñas cantidades provenidas de un<br/>amplio abanico de alimentos, tanto de origen vegetal como animal. Después de los<br/>cereales, el vino es el elemento en la dieta europea que más contribuye a la ingesta diaria<br/>de OTA.<br/>La OTA es una potente toxina que afecta principalmente los riñones, dónde puede<br/>provocar tanto lesiones agudas como crónicas. A parte de la nefrotoxicidad, estudios<br/>toxicológicos en animales han demostrado que también tiene propiedades genotóxicas,<br/>carcinogénicas e inmunosupresivas. Además, se sospecha que es la causa de una<br/>enfermedad mortal para los humanos observada en la Europa del Este y conocida como la<br/>'Nefropatía Endémica de los Balcanes', así como de la formación de tumores en el tracto<br/>urinario de humanos.<br/>Brevemente, los objetivos del presente trabajo son: (i) valorar el nivel de contaminación<br/>por OTA en bebidas españolas derivadas de la uva y estudiar la posible influencia de<br/>varias variables en el contenido de OTA de vinos y productos derivados; (ii) estudiar la<br/>micoflora de distintos viñedos españoles durante cuatro años consecutivos mediante<br/>muestreos de campo, para esclarecer dónde, cuándo y hasta que punto existe OTA en este<br/>país; (iii) identificar y estudiar el efecto de varios factores ecofisiológicos y de sus<br/>interacciones en hongos potencialmente productores de OTA aislados de uva de<br/>vinificación, para encontrar las condiciones que puedan minimizar o prevenir su<br/>crecimiento y la formación de OTA. Se llevaron a cabo estudios adicionales para<br/>investigar en primer lugar los efectos in vitro de la aplicación de fungicidas en uva,<br/>seguido del efecto de diferentes tratamientos fungicidas en uva en el campo. También se<br/>ha conseguido visualizar la colonización y los primeros estadios de infección de<br/>Aspergillus carbonarius en uva, gracias a la microscopia de fluorescencia láser confocal,<br/>epi- y estereomicroscopia, después de transformar este hongo con el gen de la proteína de<br/>fluorescencia verde (gfp).<br/>Se vio que aproximadamente un 20 % de los vinos españoles analizados contenían OTA,<br/>la mayoría a concentraciones por debajo de los límites establecidos por la UE, y que los<br/>Aspergillus negros son los responsables de la producción de esta toxina en este país,<br/>sobretodo Aspergillus carbonarius. Pese al dominio de las especies del agregado A. niger<br/>en la uva, y debido a su modesta capacidad de producir la toxina y a las bajas cantidades<br/>producidas, su contribución al problema de la OTA es ínfima. Las especies uniseriadas<br/>fueron descartadas en este aspecto, ya que no se detectó toxina en ninguna de les cepas<br/>aisladas.<br/>Se detectaron Aspergillus negros en la uva desde el cuajado hasta la cosecha, en la<br/>mayoría de viñedos. No obstante, su incidencia aumentó con la maduración de la uva,<br/>pues las altas temperaturas y humedad favorecieron el desarrollo y producción de OTA<br/>por estos hongos. Se demostró la capacidad de A. carbonarius de crecer en el intervalo<br/>10-45 ºC y 0,88-0,995 de actividad de agua (aw), con el óptimo alrededor de 30 ºC y a las<br/>más altas aw. Las condiciones de temperatura favorables para la producción de OTA<br/>fueron más restringidas, siendo 20 ºC y las altas aw las condiciones óptimas. También se<br/>estudiaron otros factores ecofisiológicos como el país de origen de las cepas, las<br/>condiciones de fotoperiodo, la alternancia de temperaturas, etc., pues el conocimiento de<br/>los factores que dan lugar a la producción de OTA pueden ayudar a diseñar estrategias<br/>para limitar su formación.<br/>En la parte final de esta tesis se han sugerido varias maneras de prevenir y controlar los<br/>Aspergillus negros y su micotoxina. Como que se ha visto que la producción de OTA por<br/>los Aspergillus negros es óptima poco tiempo después de su inoculación, la reducción del<br/>tiempo de cosecha y transporte a la bodega será decisivo para reducir los niveles de esta<br/>toxina. También se ha de procurar minimizar los daños en la piel de la uva, pues se ha<br/>visto que las aperturas fomentan la entrada del hongo que se encuentra colonizando la<br/>superficie, probablemente permitiendo la máxima producción de OTA. La<br/>implementación de otras medidas preventivas como el control de hongos patógenos y de<br/>insectos durante el crecimiento de la uva -se ensayaron varios fungicidas in vitro e in<br/>vivo-, y de otras buenas prácticas agronómicas, pueden ayudar a reducir la contaminación<br/>por OTA de la uva.<br/>Como conclusión general, se ha visto que varios factores poden ayudar a prevenir el<br/>desarrollo de los hongos ocratoxigénicos, pero es necesario aplicar un sistema de métodos<br/>combinados para controlar el crecimiento y subsiguiente producción de OTA por estos<br/>microorganismos. Las medidas preventivas son siempre preferibles a las acciones<br/>correctoras, y junto con un debido control de la OTA en los derivados de la uva,<br/>aseguraran una adecuada protección del consumidor.

Ochratoxin A (OTA) is a toxic secondary metabolite produced by moulds belonging<br/>essentially to the Aspergillus and Penicillium genera, under diverse conditions. Its<br/>presence in the human body is due to the ingestion of small quantities present in a wide<br/>range of food commodities, both of vegetable and animal origin. Next to cereals, wine in<br/>the European diet is the second major source of OTA.<br/>OTA is a potent toxin affecting mainly the kidneys, in which it can cause both acute and<br/>chronic lesions. Besides nephrotoxicity, toxicological studies on animals have<br/>demonstrated that it has mainly, genotoxicity, carcinogenicity and immunosuppressive<br/>properties. Furthermore, it is suspected to be a possible cause of the fatal human disease<br/>known as Balkan endemic nephropathy observed in South Eastern Europe, and of the<br/>urinary tract tumours in humans.<br/>Briefly, the objectives of the present project are: (i) to assess the level of OTA<br/>contamination in Spanish grape-based beverages and to study the possible influence of<br/>several variables in the OTA content of wines and derivatives; (ii) to survey the<br/>mycoflora of several Spanish vineyards during four-year consecutive field samplings, in<br/>order to clarify where, when and to what extent OTA occurs in this country; (iii) to<br/>identify and study the effect of various ecophysiological factors and their interactions on<br/>potential ochratoxigenic fungi isolated from wine grapes, in order to find out the<br/>conditions that might minimize or prevent their growth and OTA formation. Additional<br/>studies to investigate, first the impact of application of fungicides to grapes in vitro, and<br/>later the effect of different fungicide treatments on grapes in the field, were carried out.<br/>Visualization of Aspergillus carbonarius grape colonization and early infection was also<br/>achieved with epi-, stereo- and confocal fluorescence microscopy, after the<br/>transformation of this fungus with the reporter green fluorescent protein gene (gfp).<br/>It has been shown that nearly 20 % of the Spanish wines tested contained OTA, most of<br/>them at concentrations below the EU limits, and that black aspergilli are responsible for<br/>the production of this toxin in this country, mainly A. carbonarius. Despite A. niger<br/>aggregate species were dominant in grapes, because of their modest ability and low<br/>amounts produced, their contribution to the OTA problem is rather small. Uniseriate<br/>species were discarded as a source of OTA in the surveyed regions, as no toxin was<br/>detected in any of the isolates.<br/>Black aspergilli were present on grapes from setting to harvest in most of the vineyards.<br/>However, their occurrence increased with grape maturity in the field, related to the fact<br/>that high temperature and humidity favoured black aspergilli development and OTA<br/>production. It was shown the growing ability of A. carbonarius in the range 10-45 ºC and<br/>0.88-0.995 of water activity (aw), with an optimum around 30 ºC and at the highest aw.<br/>Temperature conditions for OTA production were more restrictive, with optimum<br/>detected at 20 ºC and at the highest water availability. Other ecophysiological factors<br/>such as the country of origin of the strains, photoperiod conditions, alternation of<br/>temperatures, etc. were also studied, as understanding the factors leading to OTA<br/>synthesis will enable strategies to limit its formation.<br/>Several effective ways for prevention and control of black aspergilli and their dangerous<br/>mycotoxin have been suggested in the final part of this thesis. As OTA production by<br/>black aspergilli has been shown to occur optimally very early after inoculation,<br/>minimizing the harvesting and transport time to wine cellars might be crucial to reduce<br/>the toxin levels. Attention should also be paid in minimizing damages on grape skin, as it<br/>was shown that openings trigger the entrance of the fungi colonizing the berry surface,<br/>probably enabling production of maximum amounts of OTA. The implementation of<br/>other preventive measures such as controlling pathogenic fungi and insects during grape<br/>growing -some fungicides have been tested in vitro and in vivo-, and other good<br/>agricultural practices, may help in the reduction of OTA contamination in grapes.<br/>As a general conclusion, several factors were found to help in the prevention of<br/>ochratoxigenic fungi development, but it may be necessary to apply a multiple barrier<br/>approach to control the growth and subsequent OTA production of these microorganisms.<br/>Prevention measures are always preferable to corrective actions, and together with a<br/>proper control of OTA in grape-derivatives, should ensure the adequate protection of the<br/>consumer.