Impacte ecològic i efectivitat de l'aplicació de l'antagonista Candida sake CPA-1 al camp, per al control biològic de la podridura blava en poscollita de mançanes

Abstract

El desenvolupament de resistència als fungicides per part de molts patògens en<br/>postcollita de fruita i vegetals, una manca d'adequats substituts pels fungicides i<br/>una preocupació creixent de la societat respecte als perills sanitaris i<br/>mediambientals que comporten els pesticides i els seus residus, han generat un<br/>gran interès pel desenvolupament de mètodes alternatius, efectius però més<br/>respectuosos amb el medi ambient. El control biològic mitjançant la utilització de<br/>microorganismes ha sorgit com una de les alternatives més prometedores. La soca<br/>CPA-1 del llevat Candida sake, el qual s'ha aïllat de la superfície de,mançanes al<br/>nostre laboratori, ha demostrat tenir una bona capacitat antagònica enfront els<br/>principals fongs patògens en postcollita de fruita de llavor. L'aplicació<br/>d'antagonistes en precollita per controlar les malalties de la fruita de llavor en<br/>postcollita podria ser un mètode avantatjós ja que podria prevenir infeccions<br/>latents, permetria una menor manipulació de la fruita i disminuiria potencialment<br/>els danys i ferides que es donen durant qualsevol dels tractaments de postcollita.<br/>Així mateix, es reduiria el període entre la collita i l'emmagatzemament en fred i<br/>s'evitaria la contaminació addicional per patògens que suposa el tractament químic<br/>de la fruita en el "drencher". No obstant, fins ara l'aplicació d'agents de biocontrol<br/>en el camp s'ha vist limitada per la sensibilitat que aquests tenen a l'estrès<br/>mediambiental, ja que els microorganismes tenen uns intervals de creixement molt<br/>limitats tant pel que fa a la temperatura com a la humitat.<br/>Els objectius del present estudi han estat la determinació de la dinàmica<br/>poblacional de la microflora natural de les mançanes "Golden Delicious" durant<br/>diferents estadis de desenvolupament (Capítol 2), durant la conservació en fred i<br/>durant el període de simulació de la comercialització o "shelf life" de la fruita, i<br/>avaluar l'efecte que té el tractament amb C. sake en la microflora pròpia de les<br/>mançanes (Capitol 3). D'altra banda, volia avaluar-se el potencial pràctic de la<br/>utilització de l'antagonista al camp per aconseguir un bon control de l'agent<br/>causant de la principal malaltia en postcollita de mançanes, Pénicillium expansum<br/>(Capitol 4). Tantmateix, els estudis detallats sobre l'ecofisiologia de C. sake han<br/>permès identificar mètodes per millorar la tolerància de les cèl·lules a l'estrès<br/>mediambiental, la seva viabilitat i adaptació (Capítols 5 i 6); i, mitjançant la<br/>manipulació del contingut de les reserves endògenes acumulades, millorar el<br/>creixement en el camp i aconseguir un bon nivell de biocontrol de la podridura<br/>causada per Pénicillium mitjançant el tractament a camp (Capítol 6).<br/><br/>La població microbiana total va variar segons l'estat de desenvolupament del fruit,<br/>així com també amb les condicions climàtiques. La microflora predominant en les<br/>mançanes durant el seu desenvolupament van ser les floridures Cladosporium,<br/>Alternaria spp. i els llevats blancs. D'altra banda, les floridures patògenes més<br/>importants en postcollita, P. expansum i Botrytis cinérea, rarament es van aïllar<br/>durant el desenvolupament del fruit. En canvi, la presència del gènere Pénicillium<br/>en les mançanes va esdevenir important durant la seva conservació en fred i durant<br/>el període de "shelf life" després de la conservació. La població bacteriana va ser<br/>màxima a l'estadi de borró i va disminuir durant el període de desenvolupament<br/>del fruit, essent rarament aïllades durant la collita i la conservació en fred.<br/>L'aplicació de C. sake en mançanes, dos dies abans de la collita, va reduir<br/>significativament la població de Cladosporium i Pénicillium spp. al final de la<br/>conservació en fred i durant el període de simulació de la comercialització. No<br/>obstant, l'aplicació del llevat antagonista en precollita, en mançanes foradades i<br/>inoculades artificialment va resultar menys efectiva contra la podridura per<br/>P. expansum que el tractament en postcollita amb C. saké. La població de<br/>l'antagonista aplicada en precollita sobre mançanes "Golden Delicious" i amb<br/>danys artificials, disminueix abans i més ràpidament que quan es tracta en<br/>postcollita. Es fa necessària doncs, més recerca per entendre la raó per la qual es<br/>dóna aquesta supervivència més baixa de C. sake quan s'aplica en precollita i<br/>després s'emmagatzema en fred.<br/>Es van dur a terme estudis detallats d'ecologia i fisiologia de C. sake per a<br/>identificar l'efecte de l'activitat d'aigua (ow), temperatura, pH i la seva interacció<br/>en el seu creixement per així identificar els seus límits de creixement<br/>mediambientals. Es va trobar que les condicions mediambientals en les que l'agent<br/>de biocontrol pot desenvolupar-se estan limitades per una aw mínima entre 0.90 i<br/>0.92. C. sake va resultar tolerant a un ampli rang de pH (entre 3 i 7),<br/>independentment de l'aw i la temperatura.<br/>Els polihidroxialcohols i els sucres que es van acumular en major proporció en les<br/>cèl·lules de C. sake crescudes en medi basal no modificat (NYDB) van ser arabitol,<br/>trealosa i glucosa, amb petites quantitats de glicerol i eritritol. En experiments<br/>in vitro, el creixement de C. sake en medi amb aw reduïda (0.96) va resultar en una<br/>modificació d'aquestes reserves endògenes i una millora de la viabilitat a baixaow<br/>quan es compara amb cèl·lules no modificades. En assaigs de laboratori, les<br/>cèl·lules de C. sake modificades van mantenir la seva efectivitat i fins i tot la van<br/>millorar enfront la podridura causada per P. expansum en mançanes "Golden<br/>Delicious". En assaigs de camp, però, no es van observar millores significatives en<br/>el control de la podridura per P. expansum en postcollita de mançanes foradades<br/>artificialment i infectades quan comparem cèl·lules no modificades i cèl·lulestolerants a aw baixes. Immediatament després de l'aplicació de l'antagonista en<br/>precollita, es va observar que les cèl·lules no modificades es van adherir millor a la<br/>superfície de la poma que no pas les modificades. No obstant, després d'unes hores<br/>sota condicions de camp, la població de cèl·lules aw-tolerants va augmentar<br/>significativament, mentre que la població de cèl·lules no modificades va romandre<br/>constant. És possible que els requeriments energètics per a la producció d'elevades<br/>concentracions de reserves endògenes puguin resultar en una modificació de la<br/>concentració o característiques de la matriu extracel.lular del llevat.Probablement<br/>una millora de l'adherència de les cèl·lules modificades podria donar lloc a<br/>millores en l'efectivitat.<br/>Així doncs, aquest enfoc es presenta com una via interessant per a poder<br/>aconseguir alguns avantatges en la formulació dels antagonistes, intentant fer-los<br/>més tolerants a baixes aw permetent-los-hi així, un establiment més efectiu al camp,<br/>conservant l'eficàcia com a agents de biocontrol. En aquest aspecte, l'estudi va<br/>demostrar que existeix un gran potencial per a la utilització de mitjans<br/>ecofisiològics que millorin l'adaptació ecològica dels agents de biocontrol aplicats<br/>al camp.

El desarrollo de resistencia a los fungicidas por parte de muchos patógenos de<br/>postcosecha de frutas y vegetales, la falta de substitutos adecuados a los<br/>fungicidas, y el creciente interés social sobre los peligros ambientales y de salud<br/>que tienen estos pesticidas, han generado un gran interés en el desarrollo de<br/>métodos de control alternativos que sean ambientalmente más favorables. El<br/>control biológico empleando microorganismos ha surgido como una de las<br/>alternativas más prometedoras. La levadura Candida sake (cepa CPA-1), aislada en<br/>nuestro laboratorio a partir de manzanas, ha demostrado tener actividad antagónica<br/>frente a los principales patógenos de postcosecha en fruta de pepita. Su aplicación<br/>en precosecha para el control de las enfermedades presentes en fruta de pepita en<br/>postcosecha sería beneficiosa por varias razones. En primer lugar conseguiríamos<br/>una prevención de infecciones latentes, además se requeriría una menor<br/>manipulación de la fruta y disminuiría la posibilidad de daños y heridas durante los<br/>tratamientos de postcosecha. Los períodos de tiempo entre la cosecha y la<br/>conservación en frío se reducirían y finalmente se evitaría la contaminación<br/>adicional debida a patógenos fúngicos procedentes de los tratamientos químicos de<br/>la fruta en el "drencher". Sin embargo, la aplicación de agentes de biocontrol en<br/>campo se ve limitada por la sensibilidad de los microorganismos al estrés<br/>ambiental, especialmente a la humedad relativa y a la temperatura.<br/>Los objetivos del presente estudio han sido, la determinación de la dinámica de<br/>población microbiana propia de las manzanas "Golden Delicious" a lo largo de las<br/>diferentes fases de su crecimiento (Capítulo 2), durante la conservación en frío y el<br/>período de vida útil o "shelf life", y la evaluación del efecto del tratamiento de<br/>C. sake sobre la microflora natural (Capítulo 3) . También se han llevado a cabo<br/>estudios de la aplicabilidad del agente de biocontrol en precosecha; para ello se<br/>realizaron inoculaciones en campo del antagonista con el fin de lograr un control<br/>adecuado del agente causal de la principal enfermedad de postcosecha de<br/>manzanas, P. expansum (Capítulo 4). Los estudios detallados de la ecofisiología de<br/>C. sake han fijado los métodos para mejorar la tolerancia de las células al estrés<br/>ambiental, su viabilidad y adaptación ecológica (Capítulos 5, 6) y, mediante<br/>manipulación del contenido de azúcares y polialcoholes intracelulares, el aumento<br/>de su crecimiento en campo y el mantenimiento del biocontrol de la podredumbre<br/>de Pénicillium en el tratamiento en precosecha (Capítulo 7).<br/>Se ha encontrado que la población microbiana total varía con el estado de<br/>desarrollo de la fruta y con las condiciones climáticas. La flora predominante<br/>durante el desarrollo de las manzanas fueron los mohos filamentosos<br/>Cladosporium y Alternaria spp. y las levaduras blancas. Sin embargo, los patógenos más importantes en postcosecha, P. expanswn y Botrytis cinérea,<br/>raramente fueron aislados de manzanas durante los diferentes estadios de<br/>desarrollo. Por el contrario, la presencia del género Pénicillium llegó a ser<br/>importante en las manzanas durante las etapas finales de la conservación en frío y<br/>en el período de "shelf life". La población bacteriana fue máxima en el estadio de<br/>yema y disminuyó durante el período de desarrollo de las manzanas, aislándose<br/>raramente en el momento de la cosecha y durante la conservación en frío. La<br/>aplicación en precosecha de C. saké a las manzanas dos días antes de su<br/>recolección disminuyó significativamente las poblaciones de Cladosporium y<br/>Pénicillium spp. al final de las condiciones de conservación en frío y durante el<br/>período de vida útil ambiental. Sin embargo, la aplicación en precosecha de la<br/>levadura antagonista fue menos efectiva contra la podredumbre de Pénicillium en<br/>manzanas artificialmente heridas e inoculadas que el tratamiento de postcosecha<br/>con C. sake. Las poblaciones de C. sake aplicada en precosecha sobre manzanas<br/>"Golden Delicious" y con daños artificiales, disminuyen antes y más rápidamente<br/>que cuando el tratamiento es en postcosecha. Por esta razón se necesita una<br/>investigación adicional que permita entender por qué C. sake presenta una menor<br/>supervivencia cuando la aplicación se realiza en precosecha y posterior<br/>conservación en frío. Para ello, se llevaron a cabo estudios de la ecología y<br/>fisiología de C. sake con el fin de determinar el efecto de la actividad de agua (a .),<br/>temperatura, pH y su interacción en el crecimiento del microorganismo, y poder así<br/>fijar los límites ambientales del antagonista. Se encontró que las condiciones<br/>ambientales en las cuales este agente de biocontrol crece efectivamente estaban<br/>limitadas por una aw entre 0.90 - 0.92. C. sake fue tolerante a un amplio intervalo<br/>de pH (3-7), independientemente de la temperatura y de la aw.<br/>Los principales polihidroxialcoholes y los azúcares intracelulares acumulados en<br/>C. sake crecida en un medio base no modificado (NYDB) fueron el arabitol, la<br/>trealosa y la glucosa junto con pequeñas cantidades de glicerol y eritritol. En<br/>experiencias in vitro la producción de C. sake en un medio con aw reducida (0.96)<br/>dio como resultado una modificación significativa de estas reservas endógenas y<br/>una mejora en la viabilidad a baja aw, comparada con células no modificadas. El<br/>biocontrol de P. expansum en .manzanas "Golden Delicious" se mantuvo con este<br/>inoculo modificado tolerante a baja a , y en algunos casos, incluso fue mejor en<br/>ensayos de laboratorio. Sin embargo, no se observaron mejoras significativas en el<br/>biocontrol en postcosecha de la podredumbre de P. expansum en manzanas<br/>artificialmente heridas e inoculadas en ensayos de campo con células de C. sake<br/>« .-tolerantes y no modificadas. Inmediatamente después de la aplicación en<br/>precosecha del antagonista se observó una mejor adherencia a la superficie de la<br/>manzana de las células de levadura no modificadas frente a las del inoculo modificado. No obstante, después de unas pocas horas en condiciones de campo<br/>las poblaciones del inoculo aw-tolerantes aumentaron significativamente, mientras<br/>que las poblaciones del tratamiento no modificado permanecieron sin cambios.<br/>Estos resultados nos hacen pensar que la energía necesaria para la producción de<br/>altas concentraciones de reservas endógenas pueda producir una modificación de<br/>la concentración o características de la matriz extracelular de la levadura.<br/>Probablemente una mejora en la adherencia de las células modificadas podría<br/>traducirse en una mayor efectividad.<br/>Así pues, algunas de estas ventajas ecológicas deberían ser aprovechadas en la<br/>formulación del inoculo tolerante a aw bajas para de esta forma lograr una<br/>estabilidad más efectiva en el campo, conservando su eficacia en el biocontrol.<br/>Este aspecto del estudio demostró que el empleo de medios ecofisiológicos para<br/>mejorar la adaptación ecológica de los agentes de biocontrol y para su aplicación<br/>en campo es altamente prometedora, y que ésto podría tener un profundo impacto<br/>en el desarrollo de agentes de control biológico efectivos en precosecha.

The development of resistance to fungicides by many postharvest pathogens of<br/>fruits and vegetables, a lack of adequate fungicide replacements, and growing<br/>public concern over health and environmental hazards from pesticides, have<br/>together generated new interest in the development of alternative more<br/>environmentally friendly control methods. Biological control using<br/>microorganisms has emerged as one of the most promising alternatives. The yeast<br/>Candida sake (strain CPA-1), which was isolated from the apple surface in our<br/>laboratory, has been demonstrated to have antagonistic activity against the major<br/>postharvest pathogens of pome fruits. Preharvest antagonist application for<br/>postharvest control of pome fruit diseases would be advantageous as latent<br/>infections may be prevented, less fruit manipulation would be required, and it<br/>would decrease the potential for damage and injuries during any postharvest<br/>treatments. The time periods between harvest and cold storage would be reduced<br/>and additional contamination by pathogenic fungi from drenching solutions used<br/>during chemical treatments would be avoided. However, application of biocontrol<br/>agents in the field has been limited by sensitivity to environmental stresses<br/>including a narrow relative humidity and temperature range.<br/>The aims of the present study were to determine the microbial population dynamics<br/>on Golden Delicious apples during different developmental stages (Chapter 2),<br/>during cold storage and the ambient shelf-life period, and evaluate the effect of<br/>C. sake treatment on the resident microflora (Chapter 3). Studies of the practical<br/>potential of using field inoculation of the antagonist to achieve good control the<br/>responsible agent of the major postharvest disease of apples in Spain, Pénicillium<br/>expansum, was investigated (Chapter 4). Detailed studies of the ecophysiology of<br/>C. sake identified methods for improving the environmental stress tolerance of<br/>cells, their viability and ecological fitness (Chapters 5, 6); and by manipulation of<br/>intracellular sugar alcohol and sugar content, to enhance growth in the field and<br/>conserve biocontrol of Pénicillium rot by field treatment (Chapter 7).<br/>Total microbial populations were found to vary with development stage, and with<br/>prevailing climatic conditions. The predominant mycoflora on apples during<br/>development were the filamentous fungi Cladosporium mú Alternaria spp. and<br/>white yeasts. However, the most important postharvest pathogens/1, expansum and<br/>Botrytis cinérea were seldom isolated from ripening apples. On the contrary, the<br/>presence of the Pénicillium genus became important on apples during later cold<br/>storage and ambient shelf-life period. Bacterial populations were maximum at the<br/>bud stage and decreased during the development period of apples, isolated at harvest and during cold storage. Preharvest application of C. sake to<br/>apples two days before harvest significantly decreased populations of<br/>Cladosporium and Pénicillium spp. by the end of cold storage conditions and<br/>during ambient shelf-life period. However, preharvest application of the<br/>antagonistic yeast was less effective against Pénicillium rot in artificially<br/>inoculated and wounded apples than postharvest treatment with C. sake. C, sake<br/>populations decreased faster after preharvest application than when applied<br/>postharvest during subsequent cold storage. Further research was thus needed to<br/>understand the reason for the lower survival of C. sake, when applied preharvest<br/>during subsequent cold storage. Detailed studies were carried out on the ecology<br/>and physiology of C. sake to identify the effect water activity (aw), temperature, pH<br/>and their interaction on growth and identify environmental limits of the antagonist.<br/>The environmental niche within which this biocontrol agent will effectively grow<br/>was found to be limited by about 0.90-0.92 aw. C. sake was tolerant of a wide range<br/>of pH levels (3-7) regardless of aw and temperature. The major intracellular<br/>polyols/sugars accumulated in C. sake cells grown on unmodified basal medium<br/>(NYDB) were arabitol, trehalose and glucose with small amounts of glycerol and<br/>erythritol. Production of C. sake in reduced aw media (0.96) resulted in a<br/>significant modification of these endogenous reserves and an improvement in<br/>viability at lowered aw when compared to unmodified cells in in vitro experiments.<br/>Biocontrol of P. expansum on Golden Delicious apples by these modified low owtolerant<br/>inocula was maintained, and in some cases improved in laboratory assays.<br/>However, no significant improvements were observed in postharvest biocontrol of<br/>P. expansum rot in apples artificially wounded and infected in field trials with to<br/>compare unmodified and aw-tolerant cells of C. sake. Immediately after preharvest<br/>application of the antagonist it was notable that unmodified yeast cells adhered<br/>better to the apple surfaces than the modified inocula. However, after a few hours<br/>under field conditions populations of the ow-tolerant inocula increased<br/>significantly, while those of unmodified treatment populations remained<br/>unchanged. It is also possible that the energy requirements for the production of<br/>high concentrations of endogenous reserves could result in a modification of the<br/>concentration or characteristics of the matrix. Some ecological advantages may be<br/>gained in formulating low-aw tolerant inocula for more effective establishment in<br/>the field, while conserving biocontrol efficacy. This aspect of the study<br/>demonstrated that great potential exists for using ecophysiological means for<br/>improving the ecological fitness of biocontrol agents applied in the field, and this<br/>could have a profound impact on the development of effective preharvest<br/>biological control agents for use in the field.