Bases per a la formulació de l'agent de biocontrol Candida sake CPA-1

Abstract

El desenvolupament de resistència als fungicides per part de molts patógens en<br/>postcollita de fruites i vegetals, conjuntament amb una preocupació creixent de la<br/>societat respecte als perills sanitaris i mediambientals que comporten els pesticides i els<br/>seus residus, han generat un gran interès pel desenvolupament de mètodes alternatius<br/>als productes químics de síntesi. El control biològic mitjançant la utilització de<br/>microorganismes antagònics s'ha presentat com una de les alternatives més<br/>prometedores al control químic. L'esforç que la investigació dedica a aquesta àrea ha<br/>incrementat d'una manera espectacular, i així s'està començant a reflexar en el nombre<br/>d'agents de biocontrol disponibles en el mercat o en fase de recerca. Entre ells destaca<br/>la soca CPA-1 del llevat Candida sake, aillada de la superfície de pomes en el<br/>laboratori de Patologia del Centre UdL-IRTA. Aquesta soca ha demostrat tenir una<br/>bona capacitat antagònica enfront els principals fongs patògens en postcollita de fruita<br/>de llavor. Fins al moment, C. sake ha estat patentada a Espanya i cinc països més. No<br/>obstant, cara a la comercialització d'aquest biofungicida és necessari obtenir una<br/>formulació, que permeti una presentació adequada del producte, amb una alta viabilitat<br/>i estabilitat en el temps i que faciliti la seva distribució i aplicació mitjançant les<br/>técniques ja existents. Ademes, aquesta formulació ha de tenir una efectivitat<br/>comparable a les cèl·lules fresques.<br/>L'objectiu de la present tesi ha estat l'estudi de les bases per a la formulació d'aquest<br/>agent de biocontrol. En primer lloc, es va estudiar la possibilitat de deshidratar aquest<br/>agent mitjançant la liofilització, avaluant els diferents factors que poden contribuir a<br/>incrementar la viabilitat, com el mètode de congelació i l'addició de substàncies<br/>protectores (Capítol 3), i el medi utilitzat en la rehidratació de les cèl·lules liofilitzades<br/>(Capítol 4). També es va avaluar l'efectivitat de les cél·lules liofilitzades contra<br/>Pínicillium expansion en pomes "Golden Delicious" i la seva estabilitat en condicions<br/>d'emmagatzematge (Capítol 4). Ja que la manipulació fisiològica de les condicions de<br/>creixement pot afectar significativament la qualitat de les cél·lules i la seva<br/>competència ecològica, es van dur a terme estudis per avaluar l'efecte que té la<br/>modificació de l'activitat aigua (ow) d'un medi de cultiu a base de melassa de sucre de<br/>canya en el potencial hídric de les cèl·lules (Capítol 5), en el creixement de C. sake, en<br/>l'acumulació de reserves endígenes i en la resistència a l'estrés hídric (Capítol 6).<br/>Finalment, basant-nos en aquests resultats, es va estudiar per primer cop la possibilitat<br/>de conservar les cèl·lules de C. sake en solucions líquides isotòniques (Capítol 7).<br/>Les cèl·lules de C. sake es van mostrar molt sensibles al procés de liofilització. La llet<br/>en pols desnatada, utilitzada al 10%, va presentar-se com un bon protector i va donar<br/>un producte sec porós i fàcilment rehidratable. Amb la utilització d'una solució protectora que contenia el 10% de llet en pols i el 10% de lactosa, es va aconseguir<br/>augmentar la viabilitat de les cèl·lules fins el 40%. El medi de rehidratació també es va<br/>presentar com un factor important per a la reactivado del llevat. Així, utilitzant el 10%<br/>de llet en pols com a medi de rehidratació enlloc de la solució amortidora de fosfat, la<br/>viabilitat va augmentar del 40 al 85%. Les cèl·lules liofòlitzades van reduir el<br/>percentatge de podridures causades per P. expansion en pomes "Golden Delicious". No<br/>obstant, la seva efectivitat va ser menor que la de les cél·lules fresques. La viabilitat del<br/>producte liofòlitzat va disminuir fins el 10% després de 2 mesos de conservació a 4C.<br/>El potencial hídric de les cèl·lules crescudes en el medi a base de melassa amb aw<br/>modificada i sense modificar, va disminuir en disminuir l'aw del medi de cultiu.<br/>Ademes, aquesta modificació de l'aw del medi de cultiu va provocar un canvi en les<br/>reserves endògenes de les cèl·lules de C. sake, sense afectar significativament el seu<br/>creixement quan l'aw del medi va ser de 0,98. Les cèl·lules crescudes durant 48 h en el<br/>medi de melassa no modificat i els modificats a aw de 0,98 mitjançant l'addició de<br/>glicerol o NaCl, van presentar gran resistència a l'estrés hídric. Els principals soluts<br/>acumulats en les cèl·lules de C. sake quan Vaw del medi de cultiu es va reduir van ser el<br/>glicerol i l'arabitol.<br/>El medi de cultiu, el solut utilitzat per a disminuir el potencial hídric de les solucions<br/>líquides i la temperatura de conservació, van influir en la viabilitat de C. sake<br/>conservada en medi líquid, essent el medi de melassa no modificat i els modificats a aw<br/>0,98 amb glicerol o sorbitol els millors. S'ha aconseguit una formulació isotònica que<br/>després de 7 mesos de conservació a 4C manté la seva viabilitat, i efectivitat contra<br/>P. expansion en pomes "Golden Delicious". Aquesta formulació es va preparar fent<br/>crèixer les cèl·lules en el medi de melassa modificat amb sorbitol (aw 0,98) i<br/>conservant-les amb una solució isotònica de trealosa.

El desarrollo de resistencias a los fungicidas por parte de muchos patógenos,<br/>conjuntamente con un creciente interés social sobre los riesgos medioambientales y<br/>para la salud que tienen estos pesticidas, han generado un gran interés en el desarrollo<br/>de métodos alternativos a los productos químicos de síntesis. El control biológico de<br/>las enfermedades de postcosecha en fruta de pepita se ha mostrado como una de las<br/>alternativas más prometedoras al control químico. El esfuerzo que la investigación<br/>dedica a esta área ha incrementado de manera espectacular, y eso se está empezando a<br/>reflejar en el número de agentes de biocontrol disponibles en el mercado o en fase de<br/>estudio. Entre ellos destaca la cepa CPA-1 de la levadura Candida sake aislada de la<br/>superfície de manzanas en el laboratorio de Patología del Centro UdL-IRTA. Esta cepa<br/>ha demostrado tener gran actividad antagónica contra los principales patógenos de fruta<br/>de pepita. Hasta el momento se ha patentado en España y cinco países más. Sin<br/>embargo, para su aplicación comercial, es necesario formular este agente de biocontrol,<br/>con la finalidad de presentar el producto, con una alta viabilidad y estabilidad a lo largo<br/>del tiempo y que facilite su distribución y aplicación con las técnicas ya existentes.<br/>Además, esta formulación ha de tener una efectividad comparable a la de las células<br/>frescas.<br/>El objetivo de la presente tesis ha sido el estudio de las bases para la formulación de<br/>este agente de biocontrol. En primer lugar se estudió la posibilidad de deshidratar este<br/>agente mediante liofilización, evaluando los diferentes factores que puedan contribuir a<br/>incrementar su viabilidad, como el método de congelación y la adición de sustancias<br/>protectoras (Capítulo 3), y el medio utilizado para la rehidratación de las células<br/>liofilizadas (Capítulo 4). Se evaluó la efectividad de las células liofilizadas contra<br/>Pínicillium expansion en manzanas "Golden Delicious" y su estabilidad en<br/>condiciones de almacenamiento (Capítulo 4). Como la manipulación fisiológica de las<br/>condiciones de crecimiento pueden influir significativamente en la calidad de las<br/>células y en su competencia ecológica, se llevaron a cabo estudios para evaluar el<br/>efecto que tiene la modificación de la actividad de agua (aw) de un medio de cultivo a<br/>base de melaza de azúcar de caña en el potencial hídrico de las células (Capítulo 5), en<br/>el crecimiento de C. sak�, en la acumulación de reservas endígenas y en la resistencia<br/>al estrés hídrico (Capítulo 6). Finalmente, basándonos en estos resultados, se estudió<br/>por primera vez la posibilidad de conservar las células de C. sak� en soluciones<br/>líquidas isotónicas (Capítulo 7).<br/>Las células de C. sak� se mostraron muy sensibles al proceso de liofilización. La leche<br/>en polvo desnatada utilizada al 10% se presentó como un buen protector. Además el<br/>producto obtenido fue poroso y fácilmente rehidratable. Con la utilización de una solución protectora, que contenía el 10% de leche en polvo y el 10% de lactosa, se<br/>consiguió aumentar la viabilidad de las células hasta el 40%. El medio de rehidratación<br/>también se presentó como un factor importante para la reactivación de la levadura tras<br/>su Hofllización. Así, la viabilidad de las células de C. sake utilizando el 10% de leche<br/>en polvo como medio de rehidratación en vez de tampón fosfato, aumentódel 40 al<br/>85%. Las células liofilizadas redujeron el porcentaje de podredumbre causado por<br/>P. expansum en manzanas "Golden Delicious". Sin embargo, su efectividad fue menor<br/>que la de las células frescas. La viabilidad del producto liofllizado disminuyó hasta el<br/>10% después de dos meses de conservación a 4C.<br/>El potencial hídrico de las células crecidas en un medio a base de melaza con aw<br/>modificada y sin modificar, disminuyó al disminuir la aw del medio de cultivo.<br/>Además, esta modificación de la aw del medio de cultivo, provocó un cambio en las<br/>reservas endógenas de las células de C. sake sin afectar significativamente a su<br/>crecimiento cuando la aw del medio de cultivo fue 0,98. Las células que crecieron<br/>durante 48 h en el medio de melaza no modificado y en los modificados a aw 0,98 con<br/>glicerol o NaCl presentaron una gran resistencia al estrés hídrico. Los principales<br/>solutos acumulados en las células de C. sake cuando la aw del medio de cultivo se<br/>redujo fueron el glicerol y el arabitol.<br/>El medio de cultivo, el soluto utilizado para disminuir el potencial hídrico en las<br/>soluciones líquidas y la temperatura de conservación, influyeron en la viabilidad de<br/>C. sake conservada en medio líquido, siendo los mejores el medio de melaza no<br/>modificado y los modificados a aw 0,98 con glicerol o sorbito!. Se consiguió una<br/>formulación isotónica que, después de 7 meses de conservación a 4C, mantuvo su<br/>viabilidad y efectividad contra P. expansum en manzanas "Golden Delicious". Esta<br/>formulación se preparó haciendo crecer las células en el medio de melaza modificado<br/>con sorbitol (aw 0,98) y conservándolas con una solución isotónica de trealosa.

Biological control has emerged as the most promising alternative to chemicals in<br/>controlling postharvest diseases of fruit and vegetables. The development of resistance<br/>to many fungicides by major postharvest pathogens and concern for public safety have<br/>been the main driving force in the search for new and safer methods. The research<br/>effort expended in this area has increased dramatically and this is beginning to be<br/>reflected in the number of biocontrol agents available in the marketplace or in study.<br/>Among them stands out the strain CPA-1 of the yeast Candida sake, which was<br/>isolated from the apple surface in the Pathology laboratory of the UdL-IRTA Centre.<br/>This strain has demonstrated to have antagonistic activity against the major postharvest<br/>pathogens of pome fruits. C. sake has been patented in Spain and in five other<br/>countries. However, for commercial application, this antagonist should be formulated<br/>in order to present the product in a usable form, with high viability, stability, safety,<br/>ease of distribution and application, and with retained biocontrol activity similar to that<br/>of fresh cells.<br/>The objectives of the present work were to carry out fundamental and applied studies<br/>to enable effective formulations of C. sake. Thus, dehydration of this biocontrol agent<br/>using freeze-drying was studied. The effect of freezing method and protectants was<br/>evaluated (Chapter 3), and the effect of rehydration media on viability examined<br/>(Chapter 4). Subsequently, the efficacy of such treatments against P�nicillium<br/>expansion on Golden Delicious apples, and stability of the freeze-dried C. sake cells<br/>was also investigated (Chapter 4). Because physiological manipulation of growth<br/>conditions can significantly affect quality of cells and ecological competence studies<br/>were carried out on the effect of different water activity (aw) treatments in molassesbased<br/>media on changes in internal water potentials (Chapter 5), and on growth<br/>parameters, accumulation of endogenous reserves and water stress tolerance identified<br/>(Chapter 6). Finally, based on these studies the potential for preserving C. sake cells in<br/>isotonic solutions to conserve viability and shelf-life were evaluated for the first time<br/>(Chapter 7).<br/>C. sake cells were very sensitive to the freeze-drying process. Powdered skimmed milk<br/>(SM) used at 10% concentration was shown to give good protection to cells of C. sake<br/>against freeze-drying, providing the freeze-dried product with a porous structure that<br/>made rehydration easier. The combination of 10% SM + 10% lactose was the best<br/>combination tested, with 40% of cells remaining viable after freeze-drying. The<br/>rehydration medium was shown to be a critical factor influencing the recovery of<br/>C. sake cells. Using 10% SM as a rehydration medium instead of potassium phosphate,<br/>cell viability increased from 40 to 85%. Freeze-dried C. sake cells reduced the<br/>incidence of decay caused by P. expansum in Golden Delicious apples. However, its<br/>efficacy was lower than that obtained with fresh cells. Stability of freeze-dried cells<br/>decreased during their preservation, and their viability was reduced to 10% after 2<br/>months storage at 4�C.<br/>Water potential of C. sake cells grown in molasses-based media with modified aw<br/>decreased with decreasing aw of medium. Moreover, modification of the a� of the<br/>culture medium changed the concentration of endogenous sugars and polyols without<br/>affecting significantly its growth when the aw of the medium was 0.98. Cells grown for<br/>48 h in the unmodified molasses-based medium, and in those modified to 0.98 aw with<br/>the addition of NaCl or glycerol showed high water stress resistance. The main solutes<br/>accumulated in C. sake cells in response to lowered aw of molasses media were<br/>glycerol and arabitol.<br/>Culture and preservation medium and temperature greatly influenced the viability of<br/>C. sake cells in isotonic liquid solutions. Unmodified molasses medium and those<br/>modified to 0.98 aw with the addition of glycerol or sorbitol were shown to be the best<br/>culture medium for cells of C. sake. This study enabled an isotonic liquid formulation<br/>of C. sake cells with retained viability and efficacy against P. expansum on Golden<br/>Delicious apples after 7 months of storage at 4�C to be achieved. This formulation was<br/>prepared by growing the cells in sorbitol-modified molasses medium (aw 0.98) and<br/>preserving them in an isotonic trehalose solution.