Caracterización molecular y fenotípica del género pseudallescheria y géneros afines

Abstract

Pseudallescheria es un género de ascomicetos caracterizado por ser polimórfico, ya que pueden presentar hasta tres formas morfológicamente diferentes, una forma sexual o teleomorfo y dos formas asexuales o anamorfos (sinanamorfos). Estas dos formas asexuales se clasifican en los géneros anamórficos Scedosporium y Graphium. Pseudallescheria boydi es la especie más importante del género debido a que es considerado un hongo patógeno emergente capaz de producir infecciones graves especialmente en pacientes inmnusuprimidos. Hasta la presente tesis, el anamorfo de P. boydii era Scedosporium apiospermum. <br/> En los últimos años, P. boydii ha sido objeto de diversos estudios moleculares que han mostrado su elevada variabilidad intraespecífica. Otros trabajos han puesto de relieve su variabilidad en cuanto a la respuesta a los antifúngicos así como la diferente virulencia que existe entre sus cepas. Todo ello hacía suponer que en lugar de una sola especie nos hallábamos frente a un complejo de especies. Por esta razón decidimos realizar un estudio molecular y morfológico utilizando numerosas cepas tanto clínicas como ambientales y de diferentes países. Gran parte de las cepas ambientales fueron aisladas por nosotros con la utilización del medio selectivo DRBC con benomilo. El análisis de secuencias parciales del gen de la &#946;-tubulina (dos loci) y la calmodulina y las regiones ITS del ADNr demostraron que P. boydii es un complejo de especies. El análisis combinado de las secuencias de los 4 loci nos permitió la distinción de 8 especies filogenéticas agrupadas en 4 clados diferentes. Los clados 1 y 2 fueron descritos como las nuevas especies Scedosporium aurantiacum y Pseudallescheria minutispora, respectivamente. El clado 5 consistió en 4 subgrupos incorporando las cepas tipos de P. boydii Pseudallescheria angusta, Pseudallescheria ellipsoidea y Pseudallescheria fusoidea. En el caso de los clados 3 y 4 fueron considerados únicamente como especies filogenéticas en este primer estudio. Posteriormente, para facilitar la identificación de estas 8 especies filogenéticas en laboratorios de microbiología clínica, se estudiaron las características morfológicas macro- y microscópicas mas representativas de todas ellas así como su respuesta a 59 pruebas fisiológicas. Para incrementar la robustez de los diferentes clados, aumentamos el número de nuevos aislados y de éstos se secuenció la región TUB del gen de la &#946;-tubulina, el cual previamente demostró ser el marcador molecular más informativo de los 4 evaluados. La combinación de estos estudios permitió distinguir fenotípicamente las mencionadas especies filogenéticas. La nueva especie Scedosporium dehoogii (previamente clado 3) fue descrita y Scedoporium apiospermum (previamente clado 4) y P. boydii fueron consideradas como dos especies diferentes. El nuevo nombre Scedosporium boydii fue propuesto para denominar al anamorfo de la última especie. Scedosporium dehoogii pudo ser separada del resto porque no crece a 40ºC y presenta conidioforos no ramificados. Aunque S. apiospermum fue morfológicamente indistinguible del anamorfo de P. boydii ambas especies pudieron ser separadas por su respuesta a las pruebas de la D-ribosa y por la presencia o ausencia de teleomorfo. <br/> Durante la búsqueda de nuevos aislados utilizando el medio DRBC suplementado con benomilo, aislamos un hongo interesante de suelo de Argentina que presentaba una morfología similar a la de Scedosporium. Un estudio más detallado a nivel genético y morfológico nos permitió ver que este hongo era diferente a las especies conocidas de éste y otros géneros relacionados, por lo que propusimos el nuevo género Parascedosporium. Su carácter distintivo es el desarrollo simpodial de los conidios a partir de células conidiógenas denticuladas. Este aislado resultó ser morfológicamente idéntico a Graphium tectonae, por lo que propusimos la nueva combinación Parascedosporium tectonae. El análisis filogenético de las secuencias de 4 regiones de los 3 genes ya trabajados en el primer estudio confirmó nuestra propuesta. <br/> En esta tesis también evaluamos la actividad in vitro de 11 antifúngicos (anfotericina B, albaconazol, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, posaconazol, ravuconazol, voriconazol, terbinafina, micafungina y flucitosina) utilizando el método de microdilución del CLSI contra 84 aislados pertenecientes a las 8 especies que constituyen el complejo P. boydii. Encontramos diferencias significativas entre las especies, siendo Scedosporium aurantiacum la más resistente. En general, el voriconazol fue el antifúngico más activo, seguido del posaconazol.<br/> Otro objetivo de la presente tesis fue comparar la virulencia de alguna de las diferentes especies del complejo utilizando un modelo murino con animales inmunocompetentes e inmunosuprimidos. Se seleccionaron 2 inóculos diferentes, 5x104 conidia/mL (para los animales inmunosuprimidos) y 1x106 conidia/mL (para los animales inmunocompetentes). S. aurantiacum y S. dehoogii fueron significativamente las especies más virulentas, causando la muerte del 80% y 70% de los ratones inmunocompetentes, respectivamente, mientras que el resto de las especies sólo consiguió entre un 0% y un 20% de mortalidad. <br/> Finalmente, debido a que ninguna de las cepas estudiadas de la especie más común del complejo, S. apiospermum, había desarrollado la forma sexual, consideramos interesante determinar si se trataba de una especie heterotálica. Para ello, realizamos cruzamientos con 15 cepas de S. apiospermum en todas las combinaciones posibles, incluyendo cruzamientos consigo misma. Algunos cruzamientos entre distintas cepas produjeron ascomas fértiles, mientras que los cruzamientos con subcultivos de una misma cepa resultaron autoestériles. Las cepas pudieron separarse en dos diferentes "mating types". Corroboramos el bi-alelismo del sistema de cruzamiento heterotálico mediante cruzamientos entre las ascosporas de la progenie F1 de un cruzamiento positivo. Todos estos datos confirmaron que S. apiospermum es una especie heterotálica.

Pseudallescheria boydii is a ubiquitous ascomycetous fungus that causes a wide array of human infections that can affect practically all the organs of the body. These infections have been known for a long time, but in recent years, a marked increase in severe invasive infections has been noticed, mainly in immunocompromised hosts. They present a high mortality rate and are difficult to treat. One of the most typical features of this species, which is very rare in other pathogenic fungi, is its ability to develop sexual structures on routine culture media. Until the present thesis Scedosporium apiospermum was considered the anamorph of P. boydii. <br/> Recently, it had been demonstrated that high genetic variation exists within P. boydii and other authors had reported considerable differences with respect to growth and sporulation. All these data seemed to suggest that P. boydii was probably a species complex. For this reason we performed a morphological and molecular study involving numerous strains of clinical and environmental origins and from different countries. The analysis of partial sequences of the &#946;-tubulin (two loci) and calmodulin genes and the internal transcribed spacer region of the rDNA gene demonstrated that P. boydii is a species complex. A combined analysis of the sequences of the four loci of 60 strains from different origins showed 8 phylogenetic species within this species, grouped in 5 different clades. The clades 1 and 2 were described as the new species Scedosporium aurantiacum and Pseudallescheria minutispora, respectively. Clade 5 consisted of four subgroups incorporating the ex-type strains of P. boydii, Pseudallescheria angusta, Pseudallescheria ellipsoidea and Pseudallescheria fusoidea, respectively, and clades 3 and 4 remained unnamed. Later, in order to facilitate their identification in the clinical microbiology laboratories we tried to characterize phenotypically those 8 phylogenetic species. In order to increase the robustness of the different clades, we included in this study numerous fresh isolates identified by sequencing the TUB region of the &#946;-tubulin gene, which previously was revealed as the most informative molecular marker of the four evaluated. The most representative macro- and microscopic morphological features of all them were studied and their responses to 59 physiological tests were evaluated. The combination of these studies allowed us to distinguish phenetically the mentioned phylogenetic species. The new species Scedosporium dehoogii (previously clade 3) was described and Scedoporium apiospermum (previously clade 3) and P. boydii were considered two different species The new name Scedosporium boydii was proposed for the anamorph of the latter species. Scedosporium dehoogii can be separated from the rest because it does not growth at 40ºC and present unbranched conidiophores. Although S. apiospermum were morphologically indistinguishable from the anamorph of Pseudallescheria boydii both species can be separated by the response to D-ribose test and by the presence or absence of a teleomorph. <br/> During the study of fresh isolates recovered from different geographical areas we recovered an interesting Scedosporium-like fungus from Argentinean soil samples which was proven to be genetically and morphologically different from the known species of Scedosporium and relatives. Diverse morphological and molecular studies confirmed the uniqueness of such fungus and was proposed as the new genus Parascedosporium.. This genus is mainly characterized by producing sympodial conidia from denticulate conidiogenous cells. Further studies demonstrated that such isolate was identical to Graphium tectonae and thus the new combination Parascedosporium tectonae was proposed. <br/> In this thesis we also evaluated the in vitro activities of 11 drugs (amphotericin B, albaconazole, fluconazole, itraconazole, ketoconazole, posaconazole, ravuconazole, voriconazole, terbinafine, micafungin and flucytosine) by using the microdilution method following the CLSI guidelines against 84 isolates belonging to the eight species that constitute the Pseudallescheria boydii complex. We found significant differences among the species, with Scedosporium aurantiacum being the most resistant. In general, voriconazole was the most active drug, showing a total geometric mean MIC of 0.61 g/ml, followed by posaconazole. <br/> Another objective of the present thesis was to compare the virulence of the different species of the complex using a murine model of disseminated infection by these species. We used two different inocula, i.e., 5x104 conidia/ml and 1x106 conidia/ml, for each fungal strain tested. When mice were infected with the first inoculum animals were immunosuppressed while that those infected with the second inoculum were inmunocompetent. No significant differences in mortality rates were observed (p>0.05) among the species in the immunosupressed animals. In the case of inmunocompetent animals, S. aurantiacum and S. dehoogii were clearly the most virulent species of the complex both showed the highest mean mortality rate (80% and 70%, respectively, versus 0%-20% for the other species). <br/> Finally, since none of the strains studied of the most common species of the complex, S. apiospermum, never developed the sexual state we considered of interest to determine if it was a heterothallic species. For this purpose, 15 strains of this species were paired in all possible combinations, including self-pairings to corroborate this hypothesis. All strains were self-sterile and several combinations of strains produced fertile ascomata. The strains could separate in two groups of different mating types. We corroborated the bi-allelic heterothallic mating system suggested by these results with crosses among F1 progeny ascospores from one positive mating test. All these data confirmed that S. apiospermum is a heterothallic species.