Aplicació de cèl·lules mare mesenquimals per a la regeneració de cartílag articular

Abstract

Les malalties articulars representen un problema de salut rellevant amb un prevalença molt alta (a Europa pot variar entre el 11% i el 25%) i que continua augmentant dia a dia en el món occidental. Durant els últims 20 anys, les cèl·lules mare mesenquimals adultes (CMMA) i les seves propietats regeneratives s’han estudiat intensament per trobar aplicacions factibles per a la cura d’aquestes malalties. La combinació d’aquestes cèl·lules amb materials sintètics, com els biopolímers, ha fet sorgir una nova branca mèdica, la medicina regenerativa. El treball que es presenta a continuació aborda el desenvolupament d’una teràpia basada en la medicina regenerativa pel tractament de lesions osteocondrals, on el cartílag articular afectat no es pot reparar ni regenerar per si sol. Es planteja el disseny i la realització d’un assaig preclínic per a la regeneració d’una lesió osteocondral artificial en model animal, oví en aquest cas, mitjançant una combinació de CMMA i un biopolímer. Com a punt de partida, es realitzen estudis de caracterització de les diferents fonts cel·lulars de CMMA provinents de tres teixits diferents: cartílag hialí, moll d’os i greix. S’han posat a punt els mètodes d’aïllament i expansió, i s’ha realitzat una caracterització de les cinètiques de creixement de les CMMA, obtenint resultats que indiquen una relació inversament proporcional entre la densitat de sembra i la velocitat específica màxima de creixement. Es demostra que les CMMA són mesenquimals amb l’anàlisi del fenotip, la fisiologia, la morfologia i la multipotencialitat que han mostrat al ser analitzades. Es dissenya un assaig preclínic per a la regeneració de lesions osteocondrals, en el model animal escollit, mitjançant un constructe format per CMMA i un polímer sintètic, l’Àcid poli-làctic-co-glicòlic (PLGA). La fabricació i la caracterització del constructe PLGA-CMMA es realitza en funció de l’assaig dissenyat. El PLGA s’estudia a nivell de porositat i de la seva capacitat per ser colonitzat homogèniament per les CMMA. Histològicament es demostra la colonització homogènia de les CMMA. Un cop caracteritzat el constructe es posa a punt un experiment pilot on s’aïllen CMMA de cartílag hialí extretes d’una ovella, s’expandeixen, es colonitzen en un cilindre de PLGA i es reintrodueixen artroscòpicament a l’articulació femorotibial, on prèviament s’ha generat una lesió osteocondral artificial, per avaluar la possible regeneració o reparació amb els resultats macroscòpics, imatges de ressonància magnètica i histologia de les mostres. Els resultats mostren un constructe biocompatible i bioreabsorbible que regenera cartílag hialí en alguns casos. Per confirmar aquests resultats es realitza un assaig preclínic de les mateixes característiques que el pilot, amb la comparació de les diferents fonts cel·lulars caracteritzades, amb un nombre superior d’animals i amb els temps d’estudi ampliats a 6 i 12 mesos . Els resultats mostren la seguretat del tractament desenvolupat i una eficàcia major en el tractament basat en l’aplicació de PLGA colonitzades amb CMMA provinents de moll d’os. Aquesta memòria s’estructura, doncs, de manera que inicialment es fa una introducció (capítol 1), on es realitza una descripció exhaustiva del cartílag hialí, els diferents tractaments de les patologies osteocondrals, el concepte de la medicina regenerativa, les CMMA, els biopolímers i les interaccions cèl·lula-polímer. Seguidament (capítol 2), es plantegen els principal objectius del treball. Al capítol 3 es realitza la caracterització cel·lular de les CMMA. A continuació ( capítol ) es realitzen els estudis previs amb el PLGA, les CMMA i la seva colonització, per a posar a punt el estudi pilot en model animal. Al capítol 5 es realitza l’assaig preclínic. En el capítol 6, s’exposen les principals conclusions extretes del treball. Finalment, es presenten els materials i mètodes emprats (capítol 7), i s’afegeix l’apèndix (capítol 8).

The joint diseases represent a significant health problem with a very high prevalence (in Europe varies between 11% and 25%) and still rising every day in the western world. Last 20 years, the adult mesenchymal stem cells and their regenerative properties have been studied intensively to find feasible applications for the cure of these diseases. The combination of these cells with synthetic materials such as biopolymers, has emerged a new branch of medicine, regenerative medicine. The work presented below focuses on the development of a therapy-based regenerative medicine for the regeneration of osteochondral injury where the cartilage is affected and cannot repair or regenerate itself. In this dissertation we present a design and realization of a preclinical trial for osteochondral injury regeneration, in sheep animal model, through a combination of CMMA and a biopolymer. As starting point, studies were performed to characterize different cellular sources of CMMA from three different tissues: hyaline cartilage, bone marrow and fat. Different methods have been set up for isolation and expansion of CMMA, and growth kinetics have been characterized, obtaining results that indicate an inverse relationship between seeding density and the maximum specific growth rate. We show that the CMMA are mesenchymal stem cell because of phenotype analysis, physiology, morphology and multipotentiality. A preclinical trial for regeneration of osteochondral lesions in animal model (sheep) is designed and composed by a construct consisting in CMMA colonized in a synthetic polymer, poly-Lactic Acid-co-glycolic (PLGA). The fabrication and characterization of PLGA-CMMA construct is performed based on the trial design. The PLGA is studied in terms of porosity and its ability to be homogeneously colonized by the CMMA. The homogeneous colonization of CMMA is demonstrated histologically. Once the construct is characterized, we set up a pilot experiment where hyaline cartilage was taken from a sheep and then CMMA were isolated, expanded, colonized in a cylinder of PLGA and reintroduced arthorscopically to the femorotibial joint, where previously we had generated an artificial osteochondral injury, to assess the regeneration or repair of articular cartilage. The regeneration evaluation was based on the macroscopic results, magnetic resonance imaging and histology samples. The results show the construct to be biocompatible, bioreabsorbible and hyaline cartilage regeneration in some cases. To confirm these results we performed a preclinical trial of the same features as the pilot, with comparison of different cell sources characterized before (bone marrow, hyaline cartilage and fat), with a larger number of animals and extended period study to 6 and 12 months. The results show safety and higher efficacy in the treatment based on the application of PLGA colonized with CMMA from bone marrow. This work is structured initially with an introduction (Chapter 1), which performs an exhaustive description of the hyaline cartilage, the different treatments of osteocondral pathologies, the concept of regenerative medicine, the CMMA, the biopolymers and cell-polymer interactions. Then (chapter 2), we set the main objectives of the work. In chapter 3 cellular characterization of CMMA is performed. Then (chapter 4) the preliminary studies with PLGA, the CMMA and colonization is performed in order to set up the pilot study in animal model. Chapter 5 performs preclinical trial. Chapter 6 summarizes the main conclusions of the work. Finally, there is the materials and methods (Chapter 7) used in this work, and Appendix (Chapter 8).