Changing the Intrinsic Growth Capacity of motor and sensory neurons to promote axonal growth after injury

Abstract

Les lesions dels nervis perifèrics provoquen paràlisis, anestèsia i pèrdua del control autonòmic de la zona afectada. Després de lesió, la part distal dels axons queda desconectat del soma i degenera, provocant la denervació dels òrgans diana. La degeneració walleriana crea un microambient favorable per al creixement axonal, alhora que la neurona canvia a un fenotip proregeneratiu. Malauradament, la manca d’especificitat de la regeneració, en termes de creixement motor i sensorial i reinnervació, és un dels grans limitats de la recuperació. Els mecanismes moleculars mplicats en la regeneració axonal i després de lesió són complexes i les interaccions entre els axons i la glia, els factors tròfics, la matriu extracel.lular i els seus receptors són fonamentals. Per aquestes raons, hem caracteritzat un model qeu ens permet comparar sota les mateixes condicions, creixement neurític motor i sensorial. Hem posat a punt un model in vitro, basat en cultius organotípics de medul.la espinal i explants de ganglis de les arrels dorsals de rates postnatals de 7 dies, embeguts en una matriu de col.lagen. Afegitn difernets factors tròfics a la matriu, hem avaluat la fiabilitat de les preparacions de gangli i de medul.la espinal. A més a més, també hem posat a punt un co-cultiu amb cèl.lules de Schwann dissociades que mimetizen millor l’ambient permissiu del nervi perifèric. Amb aquest model, hem analitzat els efectes de diferents factors tròfics que potencialment podien afavorir la especificitat de la regeneració, i com aquests factors podien ser sobre-regulats de manera diferencial per branques de nervis motors i sensorials després de la lesió. Hem observat que l’FGF-2 (18 kDa) és el factor tròfic que exerceix un efecte més selectiu en el creixement de les motoneurones espinals, tant a nivell d’elongació com d’arborització de neurites. El mecanisme que provocaia aquest efecte sembla estar relacionat amb la capacitat de l’FGF-2 d’incrementar la interacció entre l’FGFR-1 i el PSA-NCAM. Les interaccions dels dos receptors són importants durant els estadis més primerencs de la neuritogènesis, mentres que la subunitat alfa7B de les integrines estaria més relacionada amb l’estabilització de les neurites. Amb l’objectiu d’explorar amb més detall la potencial habilitat de l’FGF-2 de promoure de manera selectiva la regeneració in vivo, hem produit un vector lentiviral (LV) que sobreexpressa FGF-2 i l’hem caracteritzat in vitro i in vivo. L’addició de cèl.lules de Schwann infectades amb el LV-FGF2 en la matriu de col.lagen que cobreix els explants de gangli o les medul.les espinals, incrementa el creixement de les neurites motores però no de les sensorials en comparació als co-cultius amb LV-GFP. Per tant, la sobreexpressió de l’FGF2 mitjançant el LV és tan eficaç com l’addició directe del factor en la matriu en la promoció selective de la regeneració motora. Quan el LV-FGF2 es va injectar directament al nervi ciàtic in vivo, vam corroborar que l’FGF2 se secretava a nivell de la lamina basal de les cèl.lules de Schwann. Els nivells de FGF-2 en els homogentats de nervi ciàtic una setmana després d’injectar 1μl LVFGF- 2 eren més alts que els dels nervis injectats amb vehicle o LV-GFP. Per tant, el vector LV pot ser utilitzat in vivo per tal de verificar les troballes in vitro i per investigar amb més detall la capacitate de l’FGF2 de promoure regeneració motora. En aquest treball també hem comparat la capacitat de la glia embolcalladora olfactiva i les cèl.lules de Schwann, en donar suport a la regeneració in vitro de neurites motores i sensorials. En els co-cultius de cèl.lules de Schwann i els explants de gangli i medul.les espinals, s’observava un increment de la regeneració motora, menters que la glia embolcalladora incrementava signifiativament el creixement neurític de les neurones sensorials. Per contra, quan la glia embolcalladora s’afegia al cultiu motor, s’observava una agregació d’aquestes cèl.lules. El comportament de la glia embolcalladora podria estar determinat pel manteniment de la citoarquitectura de les medul.les espinals, on trobem astròcits i cèl.lules Schwann endògenes. Les interaccions entre la cèl.lula de Schwnn, la glia olafctòria i els astròcits, a través del complexe FGFR1-FGF2-HSPG, poden provocar agregació cel.lular. De fet, els nivells elevats d’HSPG van detectar-se al costat de la barrera, i això pot explicar el paper complex d’aquestes neurones. Els nivells elevats d HSPG és van detecar a la zona de lesió , i això pot explicar el paper quimio-repelent dels agregats cel.lulars.

Peripheral nerves injuries result in paralysis, anesthesia and lack of autonomic control of the affected body areas. After injury, axons distal to the lesion are disconnected from the neuronal body and degenerate, leading to denervation of the peripheral organs. Wallerian degeneration creates a microenvironment distal to the injury site that supports axonal regrowth, while the neuron body changes in phenotype to promote axonal regeneration. However, the lack of specificity of nerve regeneration, in terms of motor and sensory axons regrowth, pathfinding and target reinnervation, is one the main shortcomings for recovery. The molecular mechanisms implicated in axonal regeneration and pathfinding after injury are complex, and take into account the cross-talk between axons and glial cells, neurotrophic factors, extracellular matrix molecules and their receptors. For these reasons, we characterized a model that allows us to compare under the same conditions motor and sensory neuron regeneration. We set up an in vitro model, based on organotypic cultures of spinal cord slices and dorsal root ganglia explants from P7 rats, embedded in a collagen matrix. By adding different neurotrophic factors in the collagen matrix, we evaluated the reliability of DRG and spinal cord preparations. Moreover, we also set up a co-culture with dissociated Schwann cells to further mimic the permissive environment of the peripheral nerve. Later, we screened in vitro the different capabilities of trophic factors with promising effect on specific reinnervation of target organs after peripheral nerve regeneration. Trophic factors which promoted in vitro neuritogenesis of sensory and motor neurons were up-regulated in Schwann cells obtained from axotomized sensory and motor branches respectively. We found that FGF-2 (18 kDa) was the trophic factor that exerted the most selective effect in promoting neurite outgrowth of spinal motoneurons both in terms of elongation and arborization. The mechanism underling this effect in neuritogenesis seems related to FGF-2 enhancing the interaction between FGFR-1 and PSA-NCAM. The interaction of these two receptors is important during early stages of neuritogenesis and pathfinding, while integrin alpha7B subunit seems to play a role during neurite stabilization. With the aim to further explore the potential capacity of FGF-2 to selectiveley promote motor regeneration in vivo, we produced a lentiviral (LV) vector to overexpress FGF-2 and we characterized it in vitro and in vivo. Addition of cultured Schwann cells infected with FGF-2 into a collagen matrix embedding spinal cords or DRG significantly increased motor neurite growth but not sensory outgrowth when compared to co-cultures with LV-GFP, thus demonstrating that the LV construct was as effective as direct addition of the trophic factor to selectively promote motor neuron growth. By injecting the LV construct direclty into the sciatic nerve in vivo, we corroborated the localization of the secreted FGF-2 in the basal lamina of Schwann cells. Levels of FGF-2 from homogenated sciatic nerves one week after injection of 1μl LV-FGF-2 were higher than from nerves injected with vehicle or LV-GFP. Therefore, the LV vector can be used in vivo to verify our in vitro results and further study the capacity of FGF-2 to enhance motor nerve regeneration. In the last part of our work, we compare the abilities of Olfactory Enshealting cells and Schwann cells in sustaining in vitro motor and sensory neuritogenesis. Co-culture of cells with DRG explants and spinal cord organotypic slices was set up. SCs were promoting motoneuron growth, whereas OEC were significantly increasing neurite outgrowth in DRGs. In contrast, when OEC were added into motoneuron culture, we saw cell clusters and motoneuron outgrowth inhibition. This behaviour of OEC could be due to the maintained cytoarchitecture of the spinal cord in vitro where astrocytes and endogenous Schwann cells were also present. Interactions of SC, OEC and astrocytes through FGFR1-FGF2-HSPG complex can cause cell clustering. In fact, high levels of HSPG were found into the boundary formations, and this can explain the chemorepellent role of the cluster on neurite outgrowth.