Generation of Tolerogenic Dendritic Cells for Cell Therapy in Multiple Sclerosis

Abstract

L’esclerosi múltiple (EM) és considerada una malaltia autoimmune crònica que afecta el sistema nerviós central. Els tractaments actuals pels pacients amb EM remitent-recurrent (EM-RR) redueixen la freqüència dels brots i l’activitat inflamatòria general, però el seu efecte en la progressió de la malaltia encara no està clar. Per això és necessari desenvolupar noves aproximacions terapèutiques més específiques per tal de modificar el curs de la malaltia. En aquest sentit, una estratègia terapèutica interessant és la inhibició o supressió específica de les cèl·lules T autoreactives amb la finalitat de restablir la tolerància en malalties autoimmunitàries com l’EM. L’objectiu principal d’aquest treball ha estat la generació i caracterització de cèl·lules dendrítiques tolerogèniques (tolDCs) de pacients amb EM-RR, carregades amb pèptids de la mielina, com a eina terapèutica per restablir la tolerància als antígens de la mielina en aquests pacients. Els resultats obtinguts mostren que la utilització de diferents agents immunosupressors i estímuls de maduració permet generar tolDCs de grau clínic amb diferències rellevants per a la seva aplicació terapèutica. S’ha valorat la viabilitat, el fenotip, el perfil de les citocines produïdes, l’estabilitat i la funcionalitat d’aquestes tolDCs. La comparació de diferents agents tolerogènics de grau clínic (dexametasona, rapamicina i vitamina-D3) ha permès observar que les tolDCs tractades amb dexametasona mostren un fenotip semi-madur i produeixen grans quantitats de IL-10; que les tolDCs tractades amb rapamicina redueixen la secreció d’interferó-γ dels limfòcits T co-cultivats i expandeixen cèl·lules T reguladores; i finalment que les tolDCs obtingudes amb vitamina-D3 presenten un fenotip semi-madur, produeixen IL-10, i disminueixen la producció d’interferó-γ dels limfòcits T. Aquestes característiques, juntament amb la reproductibilitat dels resultats en les diferents mostres, fan que la vitamina-D3 hagi estat considerat l’agent més adient per generar tolDCs com a eina terapèutica per a l’EM. Tenint en compte l’estímul de maduració, el còctel de citocines pro-inflamatòries −composat per TNF-α, IL-1β i PGE-2− és considerat com a estímul maduratiu òptim per a la generació de tolDCs (obtingudes amb vitamina-D3), ja que aquestes tolDCs han estat les úniques en mostrar una estabilitat funcional i una capacitat de suprimir la resposta immunitària in vitro. La generació de tolDCs de pacients amb EM-RR (generades amb vitamina-D3 i madurades amb el còctel de citocines pro-inflamatòries) no ha mostrat diferències significatives en comparació amb tolDCs obtingudes de controls sans, ambdues presentant un perfil tolerogenic. Les tolDCs de pacients amb EM-RR carregades amb pèptids de la mielina són capaces d’induir un estat d’hipo-resposta/anergia, estable i antigen-específica, als limfòcits T autòlegs i reactius a la mielina in vitro. En resum, aquest treball ha conduit al desenvolupament d’un protocol per generar tolDCs de grau clínic i ha establert les bases per al seu ús com a eina terapèutica amb la finalitat de restablir la tolerància en pacients amb EM-RR.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease of the central nervous system. Current treatments for relapsing-remitting multiple sclerosis (RR-MS) patients decrease the frequency of relapses and reduce inflammatory activity in a nonspecific manner, but their effect on disease progression is still unclear. Therefore, in order to modify the course of MS, new and more specific therapeutic approaches are necessary. Specific inhibition or deletion of autoreactive T cells represents an interesting goal for restoring peripheral tolerance in autoimmune diseases such as MS. The main goal of this work has been to generate and characterize tolerogenic dendritic cells (tolDCs) from RR-MS patients, loaded with myelin peptides as specific antigen, as a therapeutic tool to re-establish tolerance to myelin-antigens in these patients. Our results show that using different immunosuppressive drugs and different maturation stimulus led to the generation of clinical-grade tolDCs products with differences that are relevant to therapeutic applicability. We evaluated the viability, phenotype, cytokine profile, stability and functionality of these tolDCs. The comparison of different pharmacological grade tolerogenic agents (dexamethasone, rapamycin and vitamin-D3) led to the observation that dexamethasone-treated DCs showed a semi-mature phenotype and high IL-10 secretion; that rapamycin-treated DCs impaired IFN-γ in co-cultured T cells and expanded T regulatory cells; and finally that vitamin-D3-treated DCs presented a semi-mature phenotype, produced IL-10, and reduced IFN-γ in T cells. These features, along with their reproducibility among different samples, made consider vitamin-D3 as the most convenient of the three compared agents to generate tolDCs for MS therapy. Regarding the maturation of tolDCs, the cytokine cocktail (composed by TNF-α, IL-1β and PGE-2) was determined as the optimal maturation stimulus to generate tolDCs (induced by vitamin-D3 treatment), since these tolDCs were the unique exhibiting functional stability and capability to suppress an immune response in vitro. The generation and characterization of tolDCs from RR-MS patients (generated with vitD3 and maturated with the pro-inflammatory cytokine cocktail), showed no significant differences compared with tolDCs generated from healthy controls, both presenting a tolerogenic profile. Importantly, myelin peptide-loaded tolDCs from RR-MS patients induced antigen-specific and stable hyporesponsiveness in autologous myelin-reactive T cells in vitro. Altogether this work has conducted to the development of a protocol to generate clinical-grade tolDCs and set up the bases for their use as a therapeutic tool to re-establish tolerance in RR-MS patients.