Estructura y propiedades de las placas de cromatina de los cromosomas metafásicos: Estudio mediante técnicas de microscopía TEM, AFM y Espectroscopia de Fuerza Atómica

Abstract

En nuestro laboratorio el estudio de cromosomas en presencia de una elevada concentración de iones divalentes, permitió describir por primera vez las placas de cromatina como unidad estructural básica del cromosoma metafásico compacto. En el periodo experimental de esta tesis (5 años), se han investigado extensamente estas estructuras. El estudio exhaustivo mediante TEM de placas obtenidas utilizando diferentes métodos de preparación y los diferentes controles realizados, indican que las placas no son un artefacto preparativo de esta técnica. La microscopía de fuerza atómica (AFM) ha permitido visualizar e investigar las propiedades mecánicas de las placas en solución acuosa. Las placas son finas (∼6.5 nm; determinado mediante TEM y AFM) pero resistentes a la penetración por la punta de AFM: Su módulo de Young es de ∼0.2 GPa y el estrés requerido para penetrar la superficie es de ∼0.3 GPa (Mg2+ 5-20 mM). El estudio de la desnaturalización en tiempo real (mediante AFM) y las medidas de fricción a nanoescala (Nanontribología) han permitido estudiar las propiedades estructurales de las placas en medio acuoso a temperatura ambiente. Los resultados indican que las elevadas concentraciones de NaCl y EDTA, y la digestión extensa con proteasas y nucleasa micrococal causan la desnaturalización de las placas. Los resultados nanotribológicos indican que las placas en condiciones estructurantes (Mg2+ 5 mM) tienen un coeficiente de fricción relativamente elevado (μ∼0.3), el cual es marcadamente reducido cuando se añaden elevadas concentraciones de NaCl o EDTA (μ∼0.1). La digestión con protasas incrementa el coeficiente de fricción (μ∼0.5), pero la fricción más elevada se observa cuando el DNA se rompe por acción de la nucleasa micrococal (μ∼0.9), indicando que el DNA es el componente estructural principal de las placas. Estos resultados indican que los cromosomas nativos están formados por el apilamiento de placas, que están compuestas por una red bidimensional flexible y mecánicamente resistente de DNA y proteínas.

In our laboratory the study of the chromosomes in the presence of high concentrations of divalent ions, has led us to report the chromatin plate-like structure for the first time as a fundamental element of the metaphase chromosome. In the experimental part of this Ph.D. Thesis (5 years), it has been analysed extensively this plate-like structures. The exhaustive TEM study of this planar structures obtained with different preparation procedures and the different performed controls, suggest that the plates are not an artifact of the sample preparation of this technique. The atomic force microscopy (AFM) has led us to image and investigate the mechanical properties of the plates in aqueous solution. The plates are thin (∼6.5 nm; determined by TEM and AFM) but compact and resistant to the penetration by the AFM tip: Their Young's modulus is ∼0.2 GPa and the stress required for surface penetration is ∼0.3 GPa (5-20 mM Mg2+. It has been applied a real time denaturation study (with AFM) and friction force measurements at the nanoscale (Nanotribology) to analyse the structural properties of the plates in aqueous solution at room temperature. The results show that at high concentrations of NaCl and EDTA, and extensive digestion with protease and nuclease enzymes cause plate denaturation. Nanotribology studies show that native plates under structuring conditions (5 mM Mg2+ have a relatively high friction coefficient (μ∼0.3), which is markedly reduced when high concentrations of NaCl or EDTA are added (μ∼0.1). Protease digestion increases the friction coefficient (μ∼0.5), but the highest friction is observed when DNA is cleaved by micrococcal nuclease (μ∼0.9), indicating that DNA is the main structural element of plates. This results suggest that the native chromosomes are formed by staked plates, that are composed by a flexible and mechanically resistant two-dimensional network of DNA and proteins.