Incidencia, crecimiento y estrategias de mitigación de patógenos de transmisión alimentaria para garantizar la inocuidad de fresas

Abstract

Les maduixes es consumeixen en fresc o mínimament processades, per la qual cosa és necessari establir els riscos microbiològics associats a la seva ingesta, ja que fins a l'actualitat, aquest tipus de fruites han causat nombrosos brots alimentaris relacionats amb el seu consum. L'Autoritat Europea de Seguretat Alimentària (EFSA) va sol·licitar l’any 2014 al panell BIOHAZ ('Panel on Biological Hazards'), que redactés una opinió científica sobre el risc que suposava la presència de Salmonella spp. i norovirus en la maduixa. Els resultats d'aquest informe van impulsar la presentació del projecte "Estratègies de mitigació dels problemes associats a la presència de patògens de transmissió alimentària per a la millora de la qualitat i innocuïtat en l'obtenció de maduixes congelades i llistes per al consum" (FRESAFE) que va ser finançat pel Programa Estatal de I+D+i (2013-2016), i a la qual està lligada la present tesi doctoral. En aquest treball, es va investigar per primera vegada a Espanya la qualitat microbiològica de les maduixes fresques i congelades comercialitzades en el territori nacional (Capítol 1). Els resultats van demostrar que en les mostres analitzades no es va detectar la presència de bacteris patògens (Salmonella spp., Listeria spp. i E. coli O157: H7), ni de norovirus GI i GII. En segon lloc, es va evaluar la capacitat de supervivència de Salmonella enterica en la superfície de les maduixes emmagatzemades a 4 i 20 °C, incloent la possible interacció amb les principals floridures que causen podridures en maduixa (Botrytis cinerea i Rhizopus stolonifer), desenvolupant models predictius de creixement i supervivència (Capítol 2). A més, també es van establir diverses estratègies de mitigació del risc enfocades en trobar sistemes alternatius a la desinfecció amb hipoclorit de sodi. D'una banda, es va poder observar que la desinfecció amb ozó, combinada o no amb ultrasons, no va ser una estratègia de desinfecció a considerar (Capítol 3). D'altra banda, l'àcid peracètic (AP) a 40 i 80 ppm (2 min) va ser efectiu en la reducció de S. enterica, Listeria monocytogenes i norovirus murí (MNV-1) en la fruita, amb reduccions equivalents (> 1.7 log ) a la desinfecció amb hipoclorit (NaClO, 100 ppm) (Capítol 4). Com a alternativa, es va desenvolupar també una estratègia innovadora que combina l'aplicació de llum ultraviolada (UV-C) amb l’immersió d’aigua (WUV-C) (Capítol 5). Va ser necessari un temps d'exposició de 5 minuts per reduir significativament les poblacions en les maduixes (L. monocytogenes) i en l'aigua de rentat (S. enterica i L. monocytogenes) comparat amb la desinfecció amb NaClO (200 ppm). El següent pas va ser combinar el AP a 40 ppm juntament amb l'efecte de WUV-C (WUV-C + AP). L'ús d’aquest tractament combinat, en maduixa fresca, IV gamma (Capítol 6) i congelada (Capítol 7), va permetre mantenir la qualitat de l'aigua sense la presència de microorganismes patògens als 2 min, i obtenir reduccions equivalents a la desinfecció amb NaClO (200 ppm). Durant la conservació, cal destacar que l'emmagatzematge a 4 i 10 °C durant 7 dies, i - 25 ° C durant 180 dies, no va mostrar una disminució en la infectivitat del MNV-1. Finalment, es va estudiar l’impacte dels tractaments de desinfecció sobre les maduixes inoculades amb S. enterica subesp. enterica serovar Enteritidis, i es va observar que pot arribar a afectar la seva capacitat de virulència (adhesió i invasió de les cèl·lules epitelials Caco-2) després d’una simulació gastrointestinal in vitro (Capítol 8). En resum, tot i que la incidència de microorganismes patògens en les maduixes comercialitzades a Espanya sigui baixa, els brots relacionats amb el seu consum suposen un problema a nivell global. Per això, l’AP i el WUV-C són tecnologies alternatives al clor que actuen sinèrgicament, mantenint o millorant la qualitat microbiològica de les maduixes. A més, en la present tesi doctoral es reafirma la necessitat de realitzar més estudis sobre la interacció que hi ha entre els microorganismes presents en les fruites amb els principals patògens de transmissió alimentària, així com la capacitat de virulència que presenten quan se'ls sotmet a un estrès addicional dins de la cadena alimentària, ja que s'ha observat que poden modular la seva supervivència i capacitat de virulència depenent de les variables estudiades.

Las fresas se consumen en fresco o mínimamente procesadas, por lo que es necesario establecer los riesgos microbiológicos asociados a su consumo, ya que hasta la actualidad, este tipo de frutas han causado numerosos brotes alimentarios en todo el mundo. Por consiguiente, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) solicitó en 2014 al panel BIOHAZ (‘Panel on Biological Hazards’), que redactara una opinión científica sobre el riesgo que suponía la presencia de Salmonella spp. y norovirus en fresa. Los resultados de este informe sirvieron de precedente para presentar el proyecto “Estrategias de mitigación de los problemas asociados a la presencia de patógenos de transmisión alimentaria para la mejora de la calidad e inocuidad en la obtención de fresas congeladas y listas para el consumo” (FRESAFE) financiado por el Programa Estatal de I+D+i (2013-2016), y al que está ligado la presente tesis doctoral. En este trabajo, se investigó por primera vez en España, la calidad microbiológica de las fresas frescas y congeladas comercializadas en el territorio nacional (Capítulo 1). Los resultados mostraron que en las muestras analizadas no se detectó la presencia de bacterias patógenas (Salmonella spp., Listeria spp. y E. coli O157:H7), ni de norovirus GI y GII. En segundo lugar, se evaluó la capacidad de supervivencia de Salmonella enterica en la superficie de las fresas almacenadas a 4 y 20 °C, incluyendo la posible interacción con los principales mohos causantes de podredumbre (Botrytis cinerea y Rhizopus stolonifer), desarrollando modelos predictivos de crecimiento y supervivencia (Capítulo 2). Además, también se establecieron diversas estrategias de mitigación del riesgo enfocadas en encontrar sistemas alternativos a la desinfección con cloro. Por un lado, se pudo observar que la desinfección con ozono, combinada o no con ultrasonidos, no fue una estrategia de desinfección a considerar (Capítulo 3). Por otro lado, el ácido peracético (AP) a 40 y 80 ppm (2 min) fue eficaz en la reducción de S. enterica, Listeria monocytogenes y norovirus murino (MNV-1) en fresas, con reducciones equivalentes (> 1.7 log) a la desinfección con hipoclorito sódico (NaClO, 100 ppm) (Capítulo 4). Como otra alternativa, se desarrolló una estrategia innovadora que combinó la aplicación de luz ultravioleta (UV-C) y la inmersión en agua (WUV-C) (Capítulo 5). Se necesitaron tiempos de exposición de 5 min para reducir significativamente las poblaciones en las fresas (L. monocytogenes) y en el agua de lavado (S. enterica y L. monocytogenes) comparado con la desinfección con NaClO (200 ppm). El siguiente paso fue combinar el AP a 40 ppm junto con la tecnología WUV-C (WUV-C+AP). El uso de este tratamiento combinado en fresa fresca y IV gama (Capítulo 6) y congelada (Capítulo 7), permitió mantener la calidad del agua sin la presencia de microorganismos patógenos a los 2 min, y obtener reducciones equivalentes a la desinfección con NaClO (200 ppm). Durante la conservación, cabe destacar que el almacenamiento a 4 y 10 °C durante 7 días, y - 25 °C durante 180 días, no mostró una disminución en la infectividad del MNV-1. Por último, se estudió el impacto de los tratamientos de desinfección sobre las fresas inoculadas con S. enterica subesp. enterica serovar Enteritidis, y como éstos afectaban a su capacidad de virulencia (adhesión e invasión de las células epiteliales Caco-2), después de una simulación gastrointestinal in vitro (Capítulo 8). En resumen, aunque la incidencia de microorganismos patógenos en las fresas comercializadas en España sea baja, los brotes relacionados con su consumo suponen un problema a nivel global. Por ello, el AP y el WUV-C son tecnologías alternativas al cloro que actúan sinérgicamente, manteniendo o mejorando la calidad microbiológica de las fresas. Además, en la presente tesis doctoral se reafirma la necesidad de realizar más estudios sobre la interacción que existe entre los microorganismos presentes en las frutas con los principales patógenos de transmisión alimentaria, así como la capacidad de virulencia que presentan, cuando se les somete a un estrés adicional dentro de la cadena alimentaria, ya que se ha demostrado que puede verse afectado dependiendo de las variables estudiadas.

Strawberries are usually consumed raw or minimally processed, being necessary to establish the microbiological risks associated with their consumption. In fact, this type of fruit has caused several food outbreaks in the past. In 2014, the European Food Safety Authority (EFSA) asked the BIOHAZ panel ('Panel on Biological Hazards') to wrote a scientific opinion on the risk posed by Salmonella spp. and norovirus in strawberries. The results of this report encouraged the project "Strategies to mitigate the problems associated with the presence of foodborne pathogens for the improvement of quality and safety in the production of frozen and ready-to-eat strawberries" (FRESAFE), which was funded by the ‘Programa Estatal de I+D+i (2013-2016)’, and to which this doctoral thesis is linked. In this work, the microbiological quality of fresh and frozen strawberries sold in Spain was investigated (Chapter 1). The results reported that the prescence of pathogenic bacteria (Salmonella spp., Listeria spp. and E. coli O157:H7) and norovirus GI and GII, were not detected. Then, the survivability of Salmonella enterica on the surface of strawberries stored at 4 and 20 °C was evaluated, including the possible interaction with the main postharvest fungal pathogens of strawberry fruit (Botrytis cinerea and Rhizopus stolonifer), developing predictive models of growth and survival (Chapter 2). In addition, several risk mitigation strategies were also established, focused on finding alternative systems to chlorine disinfection. On the one hand, we observed that ozone disinfection, whether or not combined with ultrasound, was not a reliable alternative disinfection strategy (Chapter 3). On the other hand, peracetic acid (PA) at 40 and 80 ppm (2 min) was effective to reduce S. enterica, Listeria monocytogenes and murine norovirus (MNV-1) in strawberry fruit, with equivalent reductions (> 1.7 log) to disinfection with chlorine (NaClO, 100 ppm) (Chapter 4). As another alternative, a strategy combining ultraviolet light application (UV-C) and water immersion (WUV-C) was developed (Chapter 5). However, exposure time of 5 min was needed to significantly reduce populations on strawberries (L. monocytogenes) and in wash water (S. enterica and L. monocytogenes) compared to disinfection with NaClO (200 ppm). The next step was to combine PA at 40 ppm together with the effect of WUV-C (WUV-C+PA). The use of the combined treatment (WUV-C+PA) on fresh and fresh-cut strawberries (Chapter 6), and frozen strawberries (Chapter 7), allowed to maintain the water quality without the presence of pathogenic microorganisms after 2 min, and obtain reductions equivalent to disinfection with NaClO (200 ppm). Strawberries stored at 4 and 10 °C for 7 days, and -25 °C for 180 days, did not represent a decrease in the infectivity of MNV-1. Finally, the impact of disinfection treatments on strawberries inoculated with S. enterica subsp. enterica serovar Enteritidis affected its pathogenic potential (adhesion and invasion of Caco-2 cell line) after an in vitro gastrointestinal simulation (Chapter 8). In summary, although the incidence of pathogenic microorganisms in strawberries sold in Spain is low, outbreaks related to their consumption are still a global problem. Therefore, PA and WUV-C are feasible alternative technologies to chlorine disinfection, maintaining or improving the microbiological quality of strawberries. Furthermore, more studies are needed on the interaction between the microorganisms present in fruits and the main human foodborne pathogens, as well as their pathogenic potential after an additional stress, as it has been shown that their survival and pathogenic potential changed depending on the variables studied.