Hyperspectral imaging application to deoxynivalenol management in wheat

Abstract

Les micotoxines són metabòlits secundaris fúngics causants de malalties en humans i animals i de reduccions del rendiment econòmic en la producció de cereals. La indústria i els proveïdors demanden noves tecnologies per detectar la seva presència abans de la seva entrada en la cadena alimentària. Les tècniques d'anàlisi convencionals per a la detecció de micotoxines són lentes, costoses, destructives i contaminants. No obstant això, les aplicacions espectroscòpiques es caracteritzen per ser ràpides, respectuoses amb el medi ambient i no destructives, depenent de la tecnologia utilitzada. Aquest treball examina l'aptitud de l'anàlisi per imatges hiperespectrals l'infraroig proper i l'espectrofotometria de transformada de Fourier a l'infraroig mitjà per detectar deoxinivalenol (DON) en dos dels cereals més consumits a escala mundial, el blat i el panís. Per aplicar HSI-NIR, el disseny metodològic passa primer per estandarditzar el procediment analític i els paràmetres de mostreig abans d'adquirir l'espectre. Es van posar a prova dos tipus de mostreigs, segons l'objectiu analític: l'anàlisi de mostra sencera i de grans individuals. Per l'anàlisi de mostra, els grans sencers i mòlts es van posicionar sota del camp de visió del sistema i es van escanejar, obtenint l'espectre infraroig. Es van determinar les concentracions d'ergosterol (metabòlit fúngic absent en les cèl·lules vegetals) i DON mitjançant HPLC com a mètode de referència. Un cop aconseguides les dades espectrals i de referència, es van modelar per quimiometria per a la calibració de models de predicció de DON i models de discriminació per rebutjar mostres per sobre del límit legal (1250 g/kg). En l'anàlisi de grans individuals, l'espectre NIR corresponent a la mitjana de píxels de cada gra fou la regió analítica d'interès. En aquest cas, els grans es varen categoritzar com a simptomàtics, lleugerament simptomàtics o sans segons els símptomes comuns de la fusariosi de l'espiga, i es varen analitzar per HPLC per determinar la concentració de DON. Un cop adquirides les dades, es van calibrar models de predicció per quantificar DON i els models de discriminació per detectar grans amb danys per Fusarium i DON (segons el límit legal de la UE) com a estratègia per separar grans contaminats. Per altra banda, es varen provar diferents dissolvents, basats en aigua, metanol, acetonitril i etanol per determinar la seva capacitat d'extracció de DON en mostres de panís contaminat, analitzades posteriorment per FTIR. En el cas de l’HSI-NIR, l'estandardització va passar per identificar la repetibilitat del mètode, l'eina de selecció de la regió d'interès més convenient i l'efecte de la posició i l'orientació dels grans. Els resultats de PCA demostren una bona repetibilitat entre mesures. A més, el mètode seleccionat per a la delimitació de la regió d'interès va ser mitjançant píxels similars amb distància Euclidiana. Els resultats també varen demostrar que la posició del gra dins el camp de visió de l'equip no afecta a la mesura espectre i que, encara que l'orientació del gra té influència sobre la projecció del gra, el dany fúngic i DON predominen per sobre d'aquesta. L'anàlisi per HPLC va demostrar la baixa correlació entre ergosterol i DON (0,61). A causa d'això, el pròxim pas va ser calibrar models de predicció independents per cada un d'aquests components. Les regressions PLS per ergosterol van presentar un rendiment per validació creuada de Rcv2 de 0,89 i un RMSECV de 1,17 mg/kg, mentre que l'habilitat de predir DON per un conjunt de validació independent va ser de R2 de 0,61 i un RMSEP de 501,4 g/kg. L'exactitud en la classificació als límits màxims establerts per la UE va ser del 85,4%.Els models de predicció de DON en grans de blat individuals varen presentar millors ajustaments amb una R2 de 0,88, encara que l'RMSEP va ser major (6,66 mg/kg), amb una rang de contaminació dels grans des de LOD fins a 135,7 mg/kg. Malgrat això, les discriminacions de grans danyats per Fusarium i contaminats amb DON foren més adequades per a l'anàlisi a concentracions properes al límit legal que els models de predicció, classificant correctament el 85,8% i 76,9% dels grans, respectivament. En l'anàlisi per FTIR, les extraccions basades amb aigua i metanol 70% es varen seleccionar per la seva tendència en agrupar mostres de panís segons el límit establert en panís (1750 g/kg) respecte als altres dissolvents i per les seves aplicacions tecnològiques. Els models SPLS-DA discriminaren mostres amb una precisió 86,7% i 90,8% per aigua i metanol (70%), respectivament. A més, els gràfics SPLS-DA mostraren una bona separació de mostres segons el límit legal i un impacte de les espècies fúngiques sobre aquestes agrupacions. Aquesta tesi demostra l'habilitat de l'HSI-NIR per detectar les contaminacions fúngiques i el DON en cereals. Encara que els models de predicció són insuficients per determinar la quantitat de DON a baixes concentracions, els models de classificació són precisos a límits propers als establerts per la UE. A més, l’anàlisi per FTIR dels extractes d’aigua i metanol (70%) també va presentar alta capacitat de discriminació. D'aquesta manera, els resultats demostren que ambdues tecnologies presenten potencial per rebutjar mostres contaminades i l'HSI-NIR és adequada com a tècnica de separació de grans contaminats.

Las micotoxinas son metabolitos secundarios fúngicos causantes de enfermedades en humanos y animales y de reducciones del rendimiento económico en la producción de cereales. La industria y proveedores de cereales demandan nuevas tecnologías para detectar su presencia antes de su entrada en la cadena alimentaria. Las técnicas de análisis convencionales para la detección de micotoxinas son lentas, costosas, destructivas y contaminantes. Sin embargo, las aplicaciones espectroscópicas se caracterizan por ser rápidas, respetuosas con el medio ambiente y no destructivas, dependiendo de la tecnología utilizada. Este trabajo examina la aptitud del análisis por imágenes hiperespectrales en el infrarrojo cercano y la espectrofotometría de transformada de Fourier en el infrarrojo medio para detectar deoxinivalenol (DON) en dos de los cereales más consumidos a nivel mundial, el trigo y el maíz. Para aplicar HSI-NIR, el diseño metodológico pasa primero por estandarizar el procedimiento analítico y los parámetros de muestreo antes de adquirir el espectro. Se pusieron a prueba dos tipos de muestreos dependiendo del objetivo analítico: el análisis de muestra entero y de granos individuales. Para el análisis de muestra, los granos a granel y molidos se escanearon bajo del campo de visión del sistema, obteniendo el espectro infrarrojo. Después, se determinaron las concentraciones de ergosterol (metabolito fúngico no presente en las células vegetales) y DON mediante HPLC como método de referencia. Además, se modelaron datos espectrales y de referencia por quimiometría para la calibración de modelos de predicción capaces de cuantificar DON y modelos de discriminación para rechazar muestras por encima del límite legal (1250 g/kg). Para el análisis de granos individuales, el espectro NIR correspondiente a la media de los píxeles de cada grano fue establecido como la región analítica de interés. En este caso, los granos se categorizaron como sintomáticos, ligeramente sintomáticos o sanos según los síntomas comunes de la fusariosis de la espiga y se analizaron por HPLC para obtener la concentración de DON. Una vez obtenidos ambos datos, se calibraron modelos de predicción de DON y los modelos de discriminación para detectar granos dañados por Fusarium y contaminados con DON (usando el límite legal de la UE) como estrategia para separarlos. Por otra parte, se probaron diferentes disolventes basados en agua, metanol, acetonitrilo y etanol para determinar su capacidad para extraer DON en muestras de maíz contaminadas, para su posterior análisis por FTIR. En el caso del HSI-NIR, la estandarización pasó por identificar la repetibilidad del método, la herramienta de selección de la región de interés más conveniente y el efecto de la posición y la orientación de los granos. Los resultados de PCA muestran una buena repetibilidad entre medidas. Además, el método seleccionado para la delimitación de la región de interés fue mediante píxeles similares con distancia Euclidiana. Los resultados también demostraron que la posición del grano dentro del campo de visión del equipo no afecta a la medida espectro y que, aunque la orientación del grano tiene influencia sobre la proyección en el PCA, el daño fúngico y DON predominan por encima de esta. El análisis por HPLC demostró la baja correlación entre ergosterol y DON (0,61). Debido a esto, el siguiente paso fue calibrar modelos de predicción independientes para cada uno de estos componentes. Las regresiones PLS por ergosterol presentaron un rendimiento por validación cruzada de Rcv2 de 0,89 y un RMSECV de 1,17 mg/kg, mientras que la habilidad de predecir DON validado con un conjunto de muestras independiente fue de R2 de 0,61 y un RMSEP de 501,4 g/kg. La exactitud en la clasificación según los límites máximos establecidos por la UE fue del 85,4%. Los modelos de predicción de DON en granos de trigo individuales presentaron mejores ajustes, con una R2 de 0,88, aunque el RMSEP fue mayor (6,66 mg/kg) con un rango de contaminación desde LOD hasta 135,7 mg/kg. Sin embargo, las discriminaciones de granos dañados por Fusarium y contaminados con DON son más adecuadas para el análisis a concentraciones cercanas al límite legal, clasificando correctamente el 85,8% y 76,9% de los granos, respectivamente. En el análisis por FTIR, se seleccionaron las extracciones basadas en agua y metanol (70%) por su mayor tendencia en agrupar muestras de maíz según el límite legal (1750 g/kg), además de sus aplicaciones tecnológicas. Los modelos SPLS-DA discriminaron muestras con una precisión 86,7% y 90,8% para agua y metanol (70%), respectivamente. Además, los gráficos de SPLS-DA mostraron una buena separación de muestras según el límite legal y un impacto de las especies fúngicas sobre estas agrupaciones. La presente tesis demuestra la habilidad del HSI-NIR para detectar las contaminaciones fúngicas y contaminaciones por DON en cereales. Aunque los modelos de predicción son insuficientes para determinar la cantidad de DON a bajas concentraciones, los modelos de clasificación son precisos en límites cercanos a los establecidos por la UE. Además, el análisis por FTIR de los extractos de agua y metanol (70%) también presentaron alta capacidad de discriminación. De esta forma, los resultados demuestran el potencial de ambas tecnologías para rechazar muestras contaminadas y la habilidad del sistema HSI-NIR como técnica de separación de granos contaminados.

Mycotoxins are fungal secondary metabolites that are harmful to human and animal health and reduce economic yield in cereal production. The cereal industry and suppliers require novel technologies to detect their presence before entering the food chain. Traditional analytical techniques for mycotoxins are time-consuming, expensive, destructive and pollutant. Contrarily, spectroscopic applications are rapid, eco-friendly and non-destructive, depending on the technology used. The present work tests the suitability of near-infrared hyperspectral imaging and Fourier transform mid-infrared to detect deoxynivalenol (DON) in two of the most consumed commodities worldwide, wheat and corn. For the HSI-NIR application, the methodological design started with the standardization of the analytical procedure and sampling parameters before the spectra acquisition. Two samplings were tested depending on the analytical purpose: wheat samples and individual wheat kernels. For sample analysis, bulk and milled wheat samples were scanned under the imaging system, obtaining their NIR spectra. Then, the samples were analysed by HPLC, determining the ergosterol (fungal metabolite not present in plant cells) and DON concentrations as the reference data. Spectral and chromatographic data were modelled using chemometric tools, calibrating predictive models for ergosterol and DON quantification and discrimination models to reject DON contaminated samples over the regulatory limits (1250 g/kg). For single grain analysis, pixels mean NIR spectra of the kernel were the analytical target. In this instance, grains were categorised as symptomatic, mildly-symptomatic or healthy according to Fusarium Head Blight common damages and analysed by HPLC, obtaining their DON concentration. Predictive models for DON quantification and discrimination models for Fusarium-damaged kernels and DON detection (at EU limits) were calibrated as a cereal sorting strategy. Additionally, several solvents, based on water, methanol, acetonitrile and ethanol, were tested, determining the DON extraction and FTIR analytical power of corn-infected samples. For HSI-NIR, the standardization started by assessing the method repeatability, the most suitable region of interest selection and the kernel orientation and location effect. The PCA results showed good repeatability between measurements. In addition, the ROI delimitation method selected was by similar pixels selection with Euclidean distance. The results also demonstrated that kernel location had no effect on the measurement and that, although the kernel orientation affected the PCA projection, fungal damage and DON contamination predominated. HPLC analysis demonstrated the weak correlation between ergosterol and DON (0.61). Consequently, the next step was to calibrate independent predictive models for each compound. PLS regression on ergosterol presented cross-validation performances of Rcv2 of 0.89 and RMSECV of 1.17 mg/kg, while DON predictive ability on an independent validation set was R2 of 0.61 and RMSEP of 501.4 g/kg. The classification results showed an accuracy of 85.4% to discriminate samples at EU regulatory limits. DON prediction results in individual wheat kernels showed better adjustment R2 of 0.88 but higher RMSEP (6.66 mg/kg) for a DON contamination ranging from LOD to 135.7 mg/kg. Alternatively, the discrimination of Fusarium-damaged and DON-contaminated kernels discrimination were more suitable than the predictive models to work at regulatory limits, with an accuracy of 85.8% and 76.9%, respectively. For FTIR, water and methanol (70%) were selected for the tendency to form clusters for maize samples contaminated above and below the DON EU limit (1750 g/kg) and their technological applications. SPLS-DA discriminated samples with an accuracy of 86.7% and 90.8% for water and methanol, respectively. In addition, the SPLS-DA score plots displayed a will-defined separation of samples according to the regulatory limit and revealed the impact of the fungal species on the clustering ability. The present thesis proves the ability of HSI-NIR to manage fungal and DON contamination in cereals. Although prediction models are insufficient for DON quantification at low concentrations, classification models are accurate enough at regulatory EU thresholds. In addition, the FTIR analysis of water and methanol 70% maize extracts exhibited also high accuracy discriminations. Thus, the general results indicate that both technologies are potent to reject contaminated samples and that HSI-NIR is suitable as a cereal sorting tool.