DNA-based precision gene writing and viral-free in vivo delivery

Abstract

The need for efficient targeted integration of large DNA fragments in mammalian genomes is indisputable, although several nuclease-based technologies have been lately developed for small allele genome editing. In this thesis, a new gene writing tool (Find Cut-And-Transfer; FiCAT) is developed combining the precision of a CRISPR-Cas9 (Find module), and the payload transfer efficiency of an engineered piggyBac transposase (Cut-And-Transfer module). FiCAT combines the functionality of Cas9 for DNA scanning and targeting, with piggyBac donor DNA processing and transfer capacity. PiggyBac has been engineered to provide increased on-target integration and reduced off-target events. FiCAT technology is applied in vivo in mouse models to deliver large payloads as a proof of concept. For that, lipid nanoparticles have been explored as a vehicle for DNA and RNA delivery, carrying a gene of interest (GOI) embedded in a transposon, and FiCAT tool as mRNA. FiCAT tool on-target efficiencies have been compared to different existing methods for large payload insertion proving to work better. Firefly luciferase reporter gene have been successfully delivered into mouse liver Rosa26 safe harbor loci using LNPs. In conclusion, FiCAT tool have been demonstrated to not only efficiently integrate big payloads of up to 9 kilobases in cells but also can be used in combination with lipid nanoparticles in vivo in mice with great future prospects for the gene therapy field.

La necessitat d’inserció dirigida dr fragments llargs de ADN en genomes de mamífer es indisputable tot i que força tecnologies basades en nucleases s’han desenvolupades últimament per l’edició de petits al·lels del genoma. En aquesta tesi es desenvolupa una nova eina d’escriptura de gens (Busca-Talla i Transfereix, en anglès Find Cut-And-Transfer-FiCAT) combinant la precisió de CRISPR (el mòdul que busca) amd l’eficiència de transferència d’ ADN d’una transposasa piggyBac modificada (el mòdul que talla i transfereix). FiCAT combina la funcionalitat de Cas9 per escanejar i trobar una seqüència en el genoma amb la capacitat de piggyBac de processar i transferir l’ADN d'interès. PiggyBac ha sigut modificada per tenir una integració on-target elevada i per tal de reduir els off-targets. La tecnologia FiCAT ha sigut aplicada in vivo en models de ratolí per integrar fragments llargs d’ADN com a prova de concepte. Per tal d’aconseguir-ho s’han explorat les nanopartícules lipídiques com a vehicle per transportar A DN i ARN, portant el gen d'interès en un transposó i l’eina FiCAT com a ARN missatger. Les eficiències on-target de FiCAT s’han comparat amb diferents mètodes ja existents i s’ha provat que funciona millor. El gen reporter de Luciferasa s’ha integrat amb èxit a la regió genòmica de Rosa26 en fetge de ratolí mitjançant nanopartícules lipídiques. En conclusió, s’ha demostrat que FiCAT no només és eficient per integrar llargs fragments d’ADN de fins a 9 kilobases en cèl·lules sino que també es pot utilitzar en combinació amb nanopartícules lipídiques in vivo en ratolins amb grans perspectives de futur pel camp de la teràpia gènica.