Importancia biosanitaria de aeromonas: Taxonomia y Epidemiologia

Abstract

El género Aeromonas está constituido por bacterias Gram-negativas aisladas frecuentemente en el agua. Adquieren relevancia por estar presentes en alimentos, y ser capaces de ocasionar cuadros diarreicos e infecciones extraintestinales en el hombre, habiéndose demostrado en la presente tesis, que pueden ser las causantes de hasta el 2% de las diarreas del viajero. <br/>La taxonomía de Aeromonas es compleja. El género consta de 15 especies difíciles de identificar con métodos bioquímicos, por lo cual en la presente tesis se ha desarrollado un protocolo, basado en los patrones de restricción del gen 16S rRNA, que permite identificar todas las especies aceptadas de Aeromonas. <br/>La mayoría de laboratorios clínicos utilizan para la identificación de las especies métodos miniaturizados semiautomáticos u otras pruebas bioquímicas que, como se demuestra en la presente tesis, conducen a identificaciones erróneas tanto a nivel de especies como del género, llegándose a confundir cepas de Aeromonas como pertenecientes a Vibrio. Para evitar esta confusión, se ha diseñado una sonda molecular, basada en el gen que codifica para la glicerofosfolípido-colesterol aciltransferasa, que es capaz de identificar las colonias de Aeromonas en medios de aislamiento primario de una forma rápida y eficaz.<br/>La correcta delimitación e identificación de las especies que integran el complejo fenotípico "A. hydrophila" (A. hydrohila, A. bestiarum, A. salmonicida y A. popoffii) constituye uno de los problemas en la taxonomía del género. Por ello, se ha considerado importante investigar las características bioquímicas y genéticas de este grupo de especies, comprobándose que las especies A. bestiarum y A. salmonicida no pueden diferenciarse mediante pruebas bioquímicas ni por métodos genéticos, por lo que sugerimos que se tratan de una única especie.<br/>Otro objetivo abordado en la tesis ha sido el estudio de los patrones de resistencia, de las especies de Aeromonas identificadas por métodos genéticos, a los agentes antimicrobianos. Se ha demostrado que las cepas de origen clínico de las especies A. hydrophila, A. caviae y A. veronii son sensibles a las cefalosporinas, aminoglucósidos, y las fluoroquinolonas. Además, se ha evidenciado que las quinolonas o las cefalosporinas de tercera generación deben considerarse como el tratamiento de elección para el tratamiento de las diarreas del viajero causadas por Aeromonas.<br/>Para poder avanzar en el conocimiento de la epidemiología de Aeromonas es imprescindible disponer de métodos moleculares de tipado fiables. En esta tesis se han evaluado tres técnicas (RFLP del espaciador intergénico 16S-23S, ERIC-PCR y REP-PCR) para el tipado molecular de Aeromonas, demostrándose que la técnica de ERIC-PCR es la más discriminativa. Sin embargo se ha observado que la combinación simultánea de dos de éstas técnicas (ERIC y REP) mejora el tipado. <br/>La virulencia de Aeromonas es compleja y posiblemente multifactorial. Se han descrito numerosos genes que codifican para diversos enzimas (hemolisinas, lipasas, DNasas, proteasas...) en los que se ha demostrado su implicación en virulencia, no obstante no existen estudios que hayan investigado simultáneamente la incidencia de todos ellos en cepas clínicas y ambientales en todas las especies del género. En esta tesis se ha investigado la distribución de los genes que codifican para estos factores de virulencia, así como la actividad enzimática que se les asocia en cepas clínicas y ambientales de todas las especies del género, demostrándose que se encuentran ampliamente presentes en todas ellas. Sin embargo se ha encontrado una asociación estadísticamente significativa entre la presencia de genes que codifican para los factores de virulencia aerolisina/hemolisina y serina proteasa y la actividad ß-hemolítica, lo que sugiere, tal como han indicado otros autores, que la serina proteasa podría actuar como activador de la aerolisina/hemolisina.<br/>Por último, hemos considerado de interés el determinar sí las especies de Aeromonas de mayor relevancia en clínica poseen el sistema de secreción tipo III, descrito en otros microorganismos patógenos como Escherichia coli, Yersinia spp. y Salmonella ssp. y, cuya función principal consiste en hacer llegar toxinas directamente al citoplasma de la célula huésped. En la presente tesis se ha demostrado que dicho sistema está presente en la mayoría de cepas clínicas de A. veronii y A. hydrophila, lo cual indica que dichas cepas poseen un potencial virulento comparable al de los patógenos mencionados.

The genus Aeromonas comprises Gram-negative bacteria frequently isolated from water. They are important because they are found in food and can provoke diarrhoea and extraintestinal infections in humans. The present thesis demonstrates that they can be aetiological agents in up to 2% of traveller's diarrhoea.<br/>Aeromonas taxonomy is complex. The genus comprises 15 species difficult to identify with classical biochemical methods. Because of this we have developed a technique based on the 16S rRNA restriction patterns that allows the identification of all the accepted species of Aeromonas. <br/>Most clinical laboratories use miniaturized semiautomatic systems or other biochemical tests to identify Aeromonas species. As we demonstrate they can give erroneous identifications as Vibrio at both species and genus level. In an attempt to avoid this confusion, we designed a molecular probe, based on the gene that codifies for glycerophospholipid-cholesterol acyltransferase, which can detect Aeromonas colonies in primary isolation media in a fast and reliable manner.<br/>The correct delimitation and identification of the species that integrate the phenotypic "A. hydrophila" complex (A. hydrohila, A. bestiarum, A. salmonicida and A. popoffii) constitutes one of the problems in the taxonomy of the genus. For that reason we considered it important to investigate the biochemical and genetic characteristics of this group of species. We have observed that the species A. bestiarum and A. salmonicida cannot be differentiated either with biochemical or with genetic methodology, suggesting that they may be unique species.<br/>Another objective was the study of the resistance patterns, in genetically identified Aeromonas species, to the antimicrobial agents. We demonstrate that clinical isolates of A. hydrophila, A. caviae and A. veronii species are susceptible to cephalosporins, aminoglycosides and fluoroquinolones. Moreover, there was evidence that quinolones and third generation cephalosporines should be considered as the treatment of choice of traveller's diarrhoea.<br/>In order to improve our knowledge of the epidemiology of Aeromonas, it is essential to have reliable molecular typing methods. We evaluated three techniques (intergenic spacer region 16S-23S RFLP, ERIC-PCR and REP-PCR) for the molecular typing of Aeromonas, and we found ERIC-PCR to be more discriminative. However, we also observed that the simultaneous combination of two of those techniques (ERIC and REP) further improved the typing.<br/>The virulence of Aeromonas is complex and possibly multifactorial. Numerous genes codifying for different enzymes (hemolysins, lipases, DNases, proteases.) have been described and their implication in virulence has been demonstrated, but there have been no studies to investigate simultaneously the incidence of all those genes in clinical and environmental isolates of all the species of the genus. In the present thesis we investigate the distribution of the genes codifying for those virulence factors, and their associated enzymatic activity on clinical and environmental isolates of all the species of the genus. We found a large presence of the genes in all the species, regardless of the origin. However, we also found a statistically significant association between the presence of genes codifying for aerolysin/hemolysin and serine protease and ß-hemolitic activity, which suggests that serine protease acts as aerolysin/hemolysin activator.<br/>Finally, we considered it of interest to determine whether the Aeromonas species with major clinical relevance possess the type III secretion system, described in other pathogenic micoorganisms, such as Escherichia coli, Yersinia spp. and Salmonella spp. The principal function of this system is to inject toxins directly into the host cell cytoplasm. We demonstrate that this system is present in most of the clinical A. veronii and A. hydrophila isolates, which indicates that those strains possess a virulence potential comparable to that of the other mentioned pathogens.